穿梅三黄散超微粉和极细粉显微特征及药效学比较研究

喻运珍,余少梅,张立强,李 娟,邓 平,罗杨志,高银爱,丁运敏

（1.武汉市农业科学院，武汉430207；2.武汉中博水产生物技术有限公司，武汉430207；3.湖北中医药大学，武汉430065；4.武汉市武湖农业发展有限公司，武汉430334）

穿梅三黄散是由大黄、黄芩、黄柏、穿心莲、乌梅五味药材粉碎加工而成的，具有清热解毒功能，用于治疗鱼类细菌性败血症、肠炎、烂鳃与赤皮病[1]。通常产品是经普通粉碎，粉末粒度在80～120目（150～180μm）之间。中草药极细粉粉末粒度在一般在150目（90μm）在200目（75μm）之间[2]。超微粉一般指细胞级微粉，利用机械或流体动力方法，将3 mm以上的中草药颗粒，加工成30μm以下粒径的粉散剂，一般粒径为5～47μm，细胞破壁率达95%以上。与传统粉散剂比较，中草药超微粉具有有效成分释放快、生物利用率高、临床作用效果显著等特点[3]。研究以穿梅三黄散为研究对象，比较了1000目超微粉和200目极细粉之间显微特征及药效学差异，旨在为穿梅三黄散超微粉应用提供试验数据参考。

1 材 料

1.1 药材 大黄、黄芩、黄柏、穿心莲、乌梅，均购自安徽旭松中药饮片有限公司，经公司质检部门按照《中华人民共和国兽药典2015年版二部》鉴定合格。穿梅三黄散由以上5种药材按比例粉碎混合而成，穿梅三黄散超微粉，委托山东埃尔派粉体科技股份有限公司生产，过1000目筛；穿梅三黄散极细粉为本公司自行粉碎生产，过200目筛。

1.2 菌株 嗜水气单胞菌（Aeromonas hydrophila）、柱状黄杆菌（Flavobacterium cloumnare）和肠型点状气单胞菌（Aromonas punctata f.intestinalis）为实验室保存菌种。

1.3 试验动物 草鱼，购置于江夏山坡某养殖户，50±5 g，置于网箱中暂养一周。

1.4 试验试剂 营养肉汤培养基和Shieh营养肉汤培养基购自青岛高科园海博生物技术有限公司。

1.5 主要仪器 BM1000生物显微镜（南京江南永新光学有限公司）；JFC－1600真空离子溅射镀膜仪、JSM－6510LV扫描电镜（日本电子公司）；Chemray 240全自动生化分析仪（深圳雷杜生命科技）；2HP－100生化培养箱（上海苏进仪器设备厂）。

2 方 法

2.1 显微观察 生物显微镜观察:取少量粉末，水合氯醛透化，于生物显微镜下观察粉末特点[4]。

电镜观察:取适量样品，用导电银胶粘在样品台上，经镀膜仪喷金后，于扫描电子显微镜下观察[5]。

2.2 抑菌试验[6－7]

2.2.1 菌液配制 将嗜水气单胞菌、柱状黄杆菌和肠型点状气单胞菌分别接种于营养肉汤培养基中，28℃下培养24 h，取培养液配制成0.5麦氏浊度的菌液备用。将柱状黄杆菌接种于Shieh营养肉汤培养基中，28℃下培养48 h，取培养液配制成0.5麦氏浊度的菌液备用。

2.2.2 药液配制 采用倍比稀释法。将穿梅三黄散紫外照射灭菌后，用无菌水配制768 mg/mL母液。取9支灭菌试管，第1管中加入5 mL肉汤培养基，2～8管加入3 mL；取1 mL母液至第1管中，混匀后吸取3 mL至第2管，混匀吸取3 mL至第3管，依次类推至第7管，混匀后，吸取3 mL弃去。1 ～7管穿梅三黄散浓度分别为 128，64、32、16、8、4、2 mg/mL。第8管为肉汤对照，第9管为药液对照。

2.2.3 最小抑菌浓度（MIC）测定 分别吸取100μL菌液加至1～8管中，28℃培养24 h后观察，没有细菌生长的最小浓度为最小抑菌浓度（MIC）。每种试验药物设3组平行，MIC结果取其平均值。

2.3 饲喂试验

2.3.1 试验分组及处理 试验在2 m×2 m×1.5 m网箱中进行，分为三组，对照组、超微粉组和极细粉组，每组投放30尾草鱼。对照组投喂普通市售饲料，用药组投喂拌药饲料，饲料添加量为20 g/kg，每日投喂3次，连续投喂10 d。

2.3.2 样品采集及指标测定[8]试验结束时，每组取草鱼6尾，尾静脉采血，4℃下静置1 h后3000 r/min离心10 min，取上清得到血清；取肝脏制成10%组织匀浆。血清用于测定谷草转氨酶（AST）、谷丙转氨酶（ALT）含量；肝组织匀浆用于测定过氧化氢酶（CAT）、丙二醛（MDA）、超氧化物歧化酶（SOD）、谷胱甘肽过氧化物酶（GSH－PX）含量。 AST、ALT采用自动生化测定仪进行测定，组织中CAT、MDA、SOD、GSH－PX采用南京建成试剂盒测定。

3 结果与分析

3.1 显微观察 穿梅三黄散极细粉在生物显微镜下可以观察到五味药材的各种特有特征（图1ag），而超微粉几乎观察不到任何细胞形态（图1h），其药物特有的特征均消失。

在扫描电镜下可以观察到，穿梅三黄散超微粉（图2b）粉体粒径更小，粒径分布更加均匀。

图1 穿梅三黄散超微粉和极细粉普通显微镜观察（×100）Fig 1 Microscopic characteristics of ultrafine and very fine powder of Chuanmei Sanhuang San observed by microscope（ ×100）

图2 穿梅三黄散超微粉和极细粉扫描电镜观察Fig 2 Microscopic characteristics of ultrafine and very fine powder of Chuanmei Sanhuang San observed by scanning electron microscope

3.2 抑菌试验 由表1可以看出，穿梅三黄散超微粉和极细粉对嗜水气单胞菌的MIC分别为32和64 mg/mL，柱状黄杆菌为32和64 mg/mL，肠型点状气单胞菌为8和32 mg/mL，超微粉对各致病菌的MIC均小于极细粉，其中对嗜水气单胞菌、柱状黄杆菌的MIC是极细粉的1/2，对肠型点状气单胞菌的MIC是极细粉的1/4。说明穿梅三黄散超微粉浸出液对3种致病菌的抑菌效果优于极细粉。

表1 穿梅三黄散超微粉和极细粉对3株细菌的最小抑菌浓度（MIC）Tab 1 MIC of ultrafine and very fine powder of Chuanmei Sanhuang San on three bacteria

3.3 饲喂试验 由表2及表3可以看出，拌饲投喂穿梅三黄散后，血清中谷草转氨酶（AST）、谷丙转氨酶（ALT）、丙二醛（MDA）含量显著降低（P＜0.05或P＜0.01），其中超微粉组小于极细粉组，具有显著性差异（P＜0.05或P＜0.01），表明饲喂穿梅三黄散能够降低试验草鱼血液中谷草转氨酶（AST）、谷丙转氨酶（ALT）酶活性及肝组织中丙二醛（MDA）含量。

过氧化氢酶（CAT）、超氧化物歧化酶（SOD）和谷胱甘肽过氧化物酶（GSH－PX）含量显著升高（P＜0.05或P＜0.01），其中超微粉组显著高于极细粉组（P＜0.05），表明饲喂穿梅三黄散能够提高试验草鱼肝组织中过氧化氢酶（CAT）、超氧化物歧化酶（SOD）和谷胱甘肽过氧化物酶（GSH－PX）酶活性。

表2 穿梅三黄散超微粉和极细粉对血清中AST和ALT影响Tab 2 Effects of ultrafine and very fine powder of Chuanmei Sanhuang San on AST and ALT in serum

表3 穿梅三黄散超微粉和极细粉对肝脏组织中SOD、CAT、GSH-PX和MDA的影响Tab 3 Effects of ultrafine and very fine powder of Chuanmei Sanhuang San on liver tissue SOD，CAT，GSH-Px，MDA

4 讨论与结论

穿梅三黄散超微粉对3种鱼类致病菌的最小抑菌浓度均小于极细粉，抑菌作用显著优于极细粉。这是因为药物粒子的大小和粉体的结构是影响药物溶出度的重要因素。穿梅三黄散经超微粉碎，粉碎更充分，粉末粒径更小（图2），有效成分更易溶出。一般情况下，中草药中有效成分需要经过浸润、溶胀、渗透和分散才能溶出，采用超微粉碎工艺消除阻力能够加快溶出速率、溶出量[9]。蔡萍等研究发现，超微粉碎技术可以显著加快五苓散中桂皮醛的体外溶出率[10]。张国祖等在研究中发现，在相同浸泡条件下，扶正解毒散超微粉中，淫羊藿苷的浸出量比普通粉平均提高了115%，水溶性浸出物提高了17%，总糖提高31%[11]。研究中，体外抑菌试验间接反映了穿梅三黄散有效抑制菌成分溶出度高于极细粉，与以上研究结果一致。

谷草转氨酶（AST）和谷丙转氨酶（ALT）是肝细胞受到损伤的敏感指标，肝细胞受损时，血液中酶活性升高；超氧化物歧化酶（SOD）、过氧化氢酶（CAT）、谷胱甘肽过氧化物酶（GSH－PX）是机体内重要的抗氧化酶，肝细胞受损时，酶活性降低；而丙二醛（MDA）是脂质过氧化的终产物，其含量变化间接反映了机体脂质过氧化水平和肝细胞损伤程度，肝细胞受到损伤时，丙二醛（MDA）含量升高[12]。研究中发现穿梅三黄散能够降低谷草转氨酶（AST）和谷丙转氨酶（ALT）酶活性，降低丙二醛（MDA）含量，提高超氧化物歧化酶（SOD）、过氧化氢酶（CAT）、谷胱甘肽过氧化物酶（GSH－PX）酶活性，说明穿梅三黄散能够改善鱼类的肝脏状况，提高肝脏抗损伤能力，其中超微粉作用效果优于极细粉。

中草药经过细胞破壁后有效成分完全释放出来，由于超微粉颗粒粒径小，因此具有表面效应、体积效应等特性，对物质的吸附性増大，有利于畜禽机体对药物的吸收利用，因而治疗效果有质的飞跃[13]。顾建明等[14]研究发现，0.5%中药超微粉能显著促进肉鸡免疫器官发育，提高机体免疫功能，且可达到1%中药粗粉的效果。李荣誉等[15]分别观察了三七、元胡、大黄超微粉对小白鼠的凝血、镇痛和肠蠕动作用的影响，超微粉作用效果优于普通粉，均得出本研究相似结论。

终上所述，穿梅三黄散超微粉能够显著提高抑菌能力及鱼类肝脏抗损伤能力。由于大多数水生动物没有胃，肠道相对较短，简单粉碎的中草药在水生动物体内留存时间短，利用率低，有的药材有效成分还没有释放出来就被排出体外，造成极大的浪费。经超微粉碎后，药物粉体活性进一步增强，溶出率提高，有效成分能够较快的进入鱼体，发挥作用，药效增强。因此，中草药超微粉在水生动物疫病防治上具有很好的应用前景。