CMV感染性肝炎患儿外周血T淋巴细胞的水平及意义

王锡兰，田 军

(余姚市第二人民医院检验科，浙江 余姚 315400)

肝炎指的是体内肝脏组织发生炎症反应，其中最常见的病因为病毒感染。有研究指出，巨细胞病毒(cytomegalovirus，CMV)具有阻滞机体免疫功能，减轻杀伤性免疫细胞杀伤力的作用[1]。因儿童发育尚未成熟，在肝脏受CMV感染时，可严重影响机体肝脏功能与免疫功能，严重损害肝脏组织，且可通过血液途径流向全身，严重时可引起患儿死亡。T淋巴细胞是一种常见的免疫细胞，其免疫活性较强，在机体受感染时，可快速做出相关的免疫应答，进而可维持体内平衡状态。本研究通过检测65例CMV感染致肝炎患儿外周血CD3、CD4、CD8及CD4/CD8 T淋巴细胞亚群的水平，进而分析其与CMV载量的相关性。

1资料与方法

1.1一般资料

选取2016年3月至2018年3月在余姚市第二人民医院就诊的65例CMV感染致肝炎患儿为病例组，男37例，女28例；年龄为5～15岁，平均为(12.14±2.43)岁。另选取同期30例体检健康儿童(均无CMV感染)为对照组，男18例，女12例；年龄为6～14岁，平均为(12.25±2.54)岁。两组性别和年龄的比较均无明显差异(均P>0.05)。根据病例组患儿CMV载量水平的不同，将其分为低载量组(CMV<1×104拷贝/mL)、中载量组(CMV为1×104～ <5×104拷贝/mL)、高载量组(CMV为5×104～10×104拷贝/mL)。本研究内容已通过我院医学伦理委员会批准。

1.2纳入与排除标准

纳入标准：年龄为5～15岁；病例组患儿存在干咳、高热等病毒性肝炎的明显临床症状；无免疫功能缺陷或功能不全；伴有严重心、脑、肺、肝、肾等器质性疾病。排除标准：酒精或药物等引起肝功能损伤；非病毒性肝炎；伴有抗病毒药物治疗史；近期使用免疫类药物；依从性较差，或中途终止参与本研究者。

1.3方法

1.3.1血液的采集

抽取清晨空腹静脉血8mL，将其放置在无病毒无菌抗凝试管中，经3 500r/min，5min离心处理后分离血清，将各个血液标本分为等量的两组，一组用于T淋巴细胞亚群的检测，另一组用于CMV载量的检测，全部标本均于2h内检测。

1.3.2外周血T淋巴细胞亚群的检测

采用荧光定量PCR仪(瑞士罗氏诊断公司，型号为z480)与T淋巴细胞亚群荧光试剂(试剂盒购自中国生物技术股份有限公司)对血液标本行免疫荧光抗体标记，分离T淋巴细胞后进行涂片，经自然干燥，固定后加样，CD3、CD4及CD8荧光标记抗体使用浓度为1∶5，孵育温度为37℃、1h。之后加入抗凝血试剂进行充分混匀，经10min后采用自动溶血仪(美国贝克曼库尔特公司，型号为Q-PRER)进行溶血，在流式细胞仪(美国 Becton Dicknson公司，型号为FACSCalibur)进行参数调整，行T淋巴细胞亚群水平的检测。对10 000个T淋巴细胞表面分子CD3、CD4及CD8的百分率进行计算，严格按照说明书指示进行检测操作。

1.3.3 CMV载量的检测

通过K3EDTA抗凝试剂对血液标本进行抗凝处理，采用荧光定量PCR仪及其配套试剂盒对CMV进行免疫荧光标记，常规提取血浆中CMV DNA，在扩增仪上行DNA扩增反应，对CMV载量水平进行检测，严格按照说明书指示进行检测操作。

1.4统计学方法

2结果

2.1病例组与对照组外周血T淋巴细胞亚群表达水平的比较

病例组患儿外周血CD3、CD4及CD4/CD8的表达水平较对照组均显著降低(均P<0.01)；而CD8水平比较并无明显差异(P>0.05)，见表1。

2.2不同CMV载量组外周血T淋巴细胞亚群表达水平的比较

根据病例组患儿CMV载量水平的不同，分为低载量组21例、中载量组29例、高载量组15例。低载量组外周血CD3、CD4及CD4/CD8的表达水平较中载量组均显著升高(q值分别为10.12、4.63、6.85，均P<0.05)，较高载量组亦均显著升高(q值分别为15.96、7.68、7.95，均P<0.05)，中载量组外周血CD3、CD4及CD4/CD8的表达水平较高载量组均显著升高(q值分别为11.05、7.36、7.84，均P<0.05)；而三组CD8水平比较并无明显差异(P>0.05)，见表2。

组别例数(n)CD3CD4CD8CD4/CD8低载量组2163.62±4.8236.99±4.1229.98±2.061.22±0.23中载量组2956.98±5.2233.96±3.1030.87±2.251.03±0.19高载量组1544.08±5.7329.78±2.7530.98±2.260.91±0.18F23.9519.531.8428.86P<0.01<0.010.17<0.01

2.3病例组CMV载量与外周血T淋巴细胞亚群水平的Pearson相关性分析

经Pearson相关性分析结果显示，CMV载量与CD3、CD4及CD4/CD8均呈现负相关关系(r值分别为-0.58、-0.53、-0.73，均P<0.01)，而与CD8的水平并无明显关系(r=0.10，P>0.05)。

3讨论

3.1 CMV的危害性

CMV是病毒性肝炎常见性的致病病毒之一，可侵入机体内肝脏、中枢及泌尿等系统，诱发诸多不良病变，可阻滞机体免疫功能，引起诸多疾病，对机体正常功能造成极大影响，甚至可引起死亡[2]。CMV对人体具有感染作用，仅在侵入人体纤维细胞时出现增殖，但可经诸多途径进行传播，对人体危害性较大。

3.2 T淋巴细胞的分类及作用

T淋巴细胞是多功能干细胞之一，来源于骨髓，可于胸腺激素作用下进行分化成具有诸多功能的免疫T细胞，并在机体正常免疫反应中发挥重要的作用[3]。根据免疫功能的不同，可将T淋巴细胞分为效应性T细胞、抑制性T细胞、细胞毒性T细胞、辅助性T细胞等亚群，多种T细胞亚群之间通过相互协调以共同维持机体正常免疫功能[4]。

3.3 CMV感染致肝炎患儿外周血T淋巴细胞亚群水平及其与CMV载量的关系

本研究发现，病例组患儿外周血CD3、CD4及CD4/CD8的表达水平较对照组均显著降低。此外，本研究中，低载量组外周血CD3、CD4及CD4/CD8的表达水平较中载量组均显著升高，较高载量组亦均显著升高，中载量组外周血CD3、CD4及CD4/CD8的表达水平较高载量组均显著升高；其次，本研究经Pearson相关性分析结果显示，CMV载量与CD3、CD4及CD4/CD8均呈现负相关关系(均P<0.01)。外周血CD3、CD4、CD8 T淋巴细胞亚群分别是淋巴细胞免疫中的辅助性、效应性及毒性细胞，且CD4/CD8比值可用于反映细胞免疫功能的状况。CMV在感染患儿机体后，主要通过分泌毒性物质以促进抑制免疫效应性和辅助性细胞因子，一方面可阻滞调节性T细胞增殖，促使调节性T细胞对免疫细胞的调节作用减弱[5]。另一方面可间接阻滞活性因子对T淋巴细胞CD3和CD4亚群的激活作用，导致机体T细胞分化成熟时出现异常，促使机体CD3和CD4 T淋巴细胞亚群的水平下降，进一步导致其对机体免疫功能的效应与辅助作用减弱，减轻机体杀伤性免疫细胞对CMV的杀伤作用[6]。

本研究发现，病例组与对照组CD8水平的比较，并无明显差异；并且不同CMV载量组的肝炎患儿CD8水平的比较并无明显差异。此外，本研究经Pearson相关性分析结果显示，CMV载量与CD8的水平并无明显关系(P>0.05)。CD8 T淋巴细胞亚群是毒性细胞之一，其主要作用在于阻滞和促使受感染细胞凋亡。在CMV感染机体时，受感染细胞增多，而CD8细胞亦会随之增多[7]，但因CMV具有阻滞调节性T细胞的作用，使得机体免疫功能出现异常，继而导致调节性T细胞对CD8细胞的活性作用，使得CD8细胞的表达水平有所降低[8]，所以病毒性肝炎患儿CD8细胞的表达水平虽有所变化，但变化幅度不大。

综上所述，CMV感染性肝炎可阻滞患儿外周血T淋巴细胞亚群CD3、CD4及CD4/CD8的水平，使得患儿免疫功能下降，CMV可阻滞外周血T淋巴细胞亚群中CD3与CD4细胞增殖，而对CD8淋巴细胞的影响较小，故此临床中应及时测定肝炎患儿外周血T淋巴细胞亚群，尤其是CD3和CD4的表达水平。

[专业责任编辑：吴红艳]