肺癌干细胞在肺癌中的研究进展

罗详冲，刘晶晶，朱家宏，安乐，浦潇，王周清#

曲靖市第二人民医院1心胸外科，2药剂科，云南 曲靖655000 0

肺癌是全球发病率和病死率均位居前列的恶性肿瘤[1]。尽管近年来肺癌的治疗已经取得了重大的进展，但是肺癌患者的总生存期（overall survival，OS）并未明显延长[2]，因此，寻找新的治疗靶点和治疗策略以提高肺癌患者的临床疗效成为了目前肺癌治疗的当务之急。肿瘤干细胞（cancer stem cell，CSC）是近年来肺癌防治研究领域的热点之一，其是一类具有无限自我更新能力并可导致肿瘤形成的细胞亚群[3]。肺癌干细胞（lung cancer stem cell，LCSC）是存在于肺癌组织中的一类具有无限增殖、自我更新能力和多向分化潜能的特殊细胞亚群。研究表明，LCSC在肺癌的发生和发展过程中可能起到了重要的作用，LCSC能够为肺癌的临床治疗提供新的治疗靶点[4]。本文就LCSC的发展史、LCSC相关标志物、LCSC的相关信号通路、针对LCSC的靶向治疗在肺癌中的研究进展作一综述。

1 LCSC的发展史

LCSC是指一群特定的能够导致肿瘤发生的细胞，具有无限增殖、自我更新和多向分化的潜能，其具备与CSC类似的生物学特性[5]。CSC引发肿瘤的形成最早是在急性粒细胞白血病（acute myeloblastic leukemia，AML）中得以证实的[6]。目前，CSC的起源仍备受争议，其可能通过祖细胞基因突变、成体干细胞（adult stem cell，ASC）基因突变及已分化的细胞经上皮-间充质转化（epithelial-mesenchymal transition，EMT）而形成[7-9]。Kim等[10]采用荧光激活细胞分选仪（fluorescence-activated cell sorter，FACS）从小鼠肺损伤模型的终末细支气管和肺泡管交界区分离出表型为Sca-1+CD45-Pecam-CD34+的细胞，并将其命名为支气管肺泡干细胞（bronchioalveolar stem cell，BASC）；在正常情况下，BASC处于静息状态，当支气管、肺泡管受到损伤时进入增殖期，可分化为克拉拉细胞、Ⅰ型肺泡上皮细胞和Ⅱ型肺泡上皮细胞，表现出明显的自我更新和多向分化潜能。当BASC发生恶性突变时可转化为LCSC。由此推测，LCSC可能起源于BASC，为LCSC的研究提供了重要证据。LCSC的提出为肺癌的发生和复发机制做出了合理解释，对于研发更加有效的抗肿瘤药物具有重大的指导意义。

2 LCSC的标志物

2.1 SP细胞

侧群细胞（side population cell，SP）又称边缘细胞，是采用Hoechst染料和流式细胞术（flow cytometry，FCM）对造血干细胞和造血祖细胞进行分离时发现的一群特殊细胞亚群，可特异性地通过细胞膜上的腺苷三磷酸结合盒式（adenosine triphosphate-binding cassette，ABC）转运蛋白将 Hoechst 33342染料快速地泵出细胞外。ABC转运蛋白主要定位于细胞膜，主要包括乳腺癌耐药蛋白（breast cancer resistance protein，BCRP，也称ABCG2）、P-糖蛋白（P-glycoprotein，P-gp，也称ABCB1）、多药耐药相关蛋白1-5（multidrug-resistant associate protein 1-5，MRP1-5）[11]。Ho等[12]采用 FCM 和 Hoechst 33342染料分离和鉴定6种人肺癌细胞株的SP细胞（H460、H23、HTB-58、A549、H441、H2170），结果表明，与非SP细胞相比，SP细胞具有更强的致瘤性、转移及化疗药物耐受能力，同时高表达ABCG2、人类端粒酶逆转录酶（human telomerase reverse transcriptase，hTERT），低表达微小染色体维持蛋白7（minichromosome maintenance protein 7，MCM7）。hTERT的存在提示肿瘤细胞具有无限增殖的能力，从而认为SP细胞具有CSC的特征。

2.2 CD133

CD133又称人Prominin-1和AC133，是一种含5个跨膜区域的细胞表面糖蛋白，该蛋白的分子量约为97 kD，由865个氨基酸组成，包括N端胞外域、5个跨膜区和一个胞内C端[13]。CD133被认为是CSC的标志物，其在直肠癌、脑胶质瘤和肺癌等肿瘤的CSC中均有表达[14]。研究表明，肺癌中含CD133+类肿瘤干细胞样细胞群，这种细胞能够自我更新，并具有高致瘤性[15]。非小细胞肺癌（non-small cell lung cancer，NSCLC）中CD133的表达情况与NSCLC的分化程度、淋巴结转移情况和疾病预后有关，高表达CD133的NSCLC患者预后较差[16-17]。含CD133+细胞的NSCLC患者对顺铂会产生耐药[18]。

2.3 ALDH

乙醛脱氢酶（aldehyde dehydrogenase，ALDH）是催化细胞内的乙醛氧化为乙酸的细胞溶质酶，能够将视黄醇氧化为视黄酸，并参与正常干细胞的分化。研究表明，乙醛脱氢酶1（aldehydedehydrogenase1，ALDH1）可作为CSC的功能性标志物[19]。Patel等[20]通过FCM发现ALDH1A1和ALDH3A1两种亚型在肺鳞状细胞癌和肺腺癌患者中呈高表达。另一项研究表明，高表达ALDH1A1的Ⅰ期NSCLC患者的生存率降低[21]。Jiang等[22]发现NSCLC中ALDH1的表达情况与肺癌细胞的增殖、分化、自我更新有关。在体外环境中，表达ALDH1+的肺癌细胞具有无限增殖、自我更新、多向分化、化疗耐药等干细胞特征。肺癌细胞表达的ALDH+对表皮生长因子受体-酪氨酸激酶抑制药（epidermal growth factor receptor-tyrosine kinase inhibitor，EGFR-TKI）——吉非替尼（gefitinib）具有一定的耐药性[23]。上述研究表明ALDH1可以作为LCSC的一个功能性标志物。

2.4 CD44

CD44是细胞表面的一种跨膜糖蛋白，在恶性肿瘤的发生、发展过程中起到重要的作用。研究表明，CD44在肺鳞状细胞癌中的阳性表达率为89.5%[24]。Liu等[25]采用逆转录聚合酶链反应（reverse transcription-polymerase chain reaction，RTPCR）检测发现Nanog基因在CD44+阳性LCSC中的表达水平高，说明Nanog基因在细胞恶性表型的形成过程中起着重要的作用[26]。另一项研究表明，CD44的高表达是肺腺癌复发的高危因素[27]。除此之外，Leung等[28]采用FCM检测发现，CD44+的NSCLC细胞比CD44-的NSCLC细胞更具有成瘤能力，同时，CD44+的NSCLC细胞比CD44-的NSCLC细胞对顺铂的耐药性更强。因此，CD44可能成为LCSC的分子标志物。

2.5 其他标志物

除上述标志物之外，用于分离LCSC的细胞表面分子标志物还有Oct4、Sox2、Nanog、阶段特异性胚胎表面抗原4（stage specific embryonic antigen 4，SSEA4）、CD166、CD24、CD147等。Chen 等[29]通过对肺癌患者进行研究发现，CD133+细胞中Oct-4的表达水平高于CD133-细胞；当Oct-4的表达受到抑制时，其成瘤能力下降。目前，对于LCSC标志物的研究是一个热点，单个标志物对于肺癌诊断的特异度和灵敏度均较低，可通过联合多种标志物提高肺癌的早期诊断率；同时，对于LCSC标志物的研究可为肺癌的靶向治疗策略带来广阔前景。

3 LCSC相关信号通路

3.1 Wnt信号通路

Wnt信号通路参与细胞的增殖、分化、迁移和凋亡等多种细胞生长过程，并且与多种肿瘤的发生、发展有关。Wnt信号通路包括经典途径[Wnt/β-连环蛋白（β-catenin）途径]和非经典途径[Wnt/Ca2+和Wnt/应激活化蛋白激酶（stress-activated proteinkinases，SAPK，也称JNK）途径]。其中，经典的Wnt信号通路在肿瘤的增殖和分化过程中起着重要的作用。当经典的Wnt通路被激活时，Wnt蛋白与细胞表面的跨膜受体卷曲蛋白（Frizzled，Frz）、低密度脂蛋白受体相关蛋白5/6（low-density lipoprotein receptor-related protein 5/6，LRP5/6）结合形成三聚体，激活细胞质内的蓬乱蛋白，降低由βcatenin与糖原合成酶激酶-3β（glycogen synthase kinase-3β，GSK-3β）、轴蛋白（axin）、结直肠腺瘤性息肉病基因（adenomatous polyposis coli，APC）组成的复合物的稳定性，使磷酸化的β-catenin不能被降解，处于去磷酸状态的β-catenin在细胞质内累积，进而进入细胞核内与T细胞因子/淋巴样增强因子（T-cell factor/lymphoid enhancer factor，TCF/LEF）相互作用，激活下游靶基因的转录[30]。Teng等[31]研究发现，上调A549细胞中β-catenin的表达，可抑制A549细胞的增殖、克隆形成、迁移及耐药性。另一项研究发现，非典型Wnt途径中的配体Wnt5a可以促进A549肺腺癌细胞和顺铂耐药A549/DDP细胞的增殖、侵袭、迁移，同时增加A549/DDP细胞中ALDH+细胞的比例[32]。上述研究表明，对Wnt信号通路的靶向抑制可能成为肺癌治疗的新策略。

3.2 Notch信号通路

Notch信号通路是在进化方面具有高度保守性的细胞间信号转导系统，共包含4种Notch受体（Notch 1～Notch 4）和 5个配体（Jagged1、Jagged2、Delta-like1、Delta-like3、Delta-like4），其在细胞的增殖、分化和凋亡等多种生物功能中发挥着重要的作用，同时信号转导异常会导致肿瘤的发生。当Notch配体（Delta、Jagged）与受体结合后，受体由肿瘤坏死因子α转化酶（tumor necrosisi factor α converting enzyme，TACE）和γ-分泌酶（γ-secretase）催化发生一系列水解，形成活化的胞内区（notch intracellular domain，NICD），并进入细胞核与转录因子（CBF1/RBP-Jk/Suppressor of Hairless/LAG-1，CSL）结合，进一步激活发状分裂相关增强子（hairy and enhancer of split，HES）、Myc、p21等下游靶基因的表达[33]。研究表明，Notch信号通路对NSCLC细胞的增殖和凋亡具有重要作用。抑制Notch1受体能够促进肺腺癌A549细胞的增殖，同时抑制其凋亡，但是，对肺鳞癌细胞的增殖与凋亡无明显影响[34]。Hassan等[35]研究发现高活性的Notch与肺腺癌的致瘤性和肿瘤耐药性等有关。此外，Notch信号通路对小细胞肺癌（small cell lung cancer，SCLC）的生物学行为也具有重要影响。Meder等[36]通过体外实验激活NOTCH-ASCL1-RB-p53信号通路可灭活Notch基因的突变进而维持SCLC表型，提示Notch通路与LCSC之间具有一定的相关性。

3.3 Hedgehog信号通路

Hedgehog信号通路在胚胎发育及维持机体内环境稳态等多种生理过程中起着重要作用。该通路主要由 3种配体[Sonic Hedgehog（Shh）、Indian Hedgehog（Ihh）和Desert Hedgehog（Dhh）]、2种跨膜受体蛋白[Patched（PTCH）和 Smoothened（SMO）]及3种转录因子 GLI（GLI1、GLI2、GLI3）]构成。在Hedgehog信号通路转导过程中通过正负反馈调节下游靶基因的表达情况，各环节均受到严密的基因调控，当信号通路被异常激活时则多种肿瘤形成[37]。研究表明，Hedgehog信号通路在肺癌、胰腺癌、乳腺癌等多种恶性肿瘤的发生和发展过程中起到重要作用[38-39]。在肺鳞癌组织中，Hedgehog信号通路的激活与PTCH1SMO表达水平的升高有关，哺乳动物叉头框蛋白M1（forkhead box protein M1，FOXM1）过表达也与PTCH1、SMO和GLI1的表达密切相关[38]，而FOXM1在细胞增殖的调控中起关键作用。Lemjabbar-Alaoui等[40]研究发现暴露于香烟烟雾中的支气管上皮细胞具有独立的生长性，能够激活Hedgehog信号通路并在裸鼠中形成肿瘤，这些结果表明肺癌可能通过Hedgehog通路的激活促进肺泡上皮细胞的自我更新，因此，抑制Hedgehog信号通路的信号转导可成为肺癌治疗的新途径。

3.4 其他信号通路

除上述几种信号通路外，SCF-c-kit（CD117）信号通路及STAT3通路等在LCSC的相关调控中也均起到一定的作用[41-42]。信号通路在LCSC增殖、自我更新、侵袭、转移、耐药等过程中均发挥着重要的作用，但仍需深入地研究并阐述各通路在LCSC中的作用机制，通过阻断上述LCSC中的信号转导通路可能为肺癌的治疗提供新的靶点，也将成为以后的研究趋势及热点。

4 LCSC在SCLC中的靶向治疗研究进展

研究表明，RRX-001抑制剂可通过靶向CSC逆转SCLC的化疗耐药。该研究是一项多中心开放的RRX-001临床Ⅱ期试验（NCT02489903），纳入26例铂类耐药/难治性SCLC或接受二线以上治疗的SCLC患者，结果显示，接受RRX-001治疗患者的1年生存率为45.6%，中位无进展生存期（progression free survival，PFS）为7.5个月，其中12例SCLC患者接受RRX-001治疗后开始进行依托泊苷/顺铂化疗，疾病控制率（disease control rate，DCR）为75%，客观缓解率（objective response rate，ORR）为33%。上述研究提示，可通过靶向CSC逆转SCLC的化疗耐药性，从而提高SCLC患者的治疗效果[43]。

5 LCSC在NSCLC中的靶向治疗研究进展

LCSC的相关研究对NSCLC的治疗具有重要的作用。目前存在5种治疗策略：①针对LCSC代谢弱点的靶向治疗。Fernandez等[44]发现在NSCLC细胞中，LCSC的代谢过程存在1个弱点，并发现LCSC通过线粒体的柠檬酸转运蛋白（Na+-coupled citrate transporter，NaCT）SLC25A1的活性，依赖氧化磷酸化（oxidative phosphorylation）所产生的能量来维持细胞的存活。这表明，SLC25A1在维持CSC柠檬酸的储备和氧化还原平衡中起着关键的作用，抑制SLC25A1的活性能够抑制LCSC的自我更新。此外，通过进一步的研究还发现，在不同的肿瘤中，通过介导SLC25A1的活性可诱导LCSC产生干性表型，从而获得对顺铂或EGFR-TKI治疗的耐药性。同时，发现一种SLC25A1特异性抑制剂与顺铂或EGFR-TKI联合使用能够产生更好的抗肿瘤反应。②抑制LCSC EMT。有研究表明，EMT在维持CSC干性方面发挥着重要的作用，且干性肿瘤细胞高表达EMT相关标志物[45-47]。通过诱导EMT过程的发生可使NSCLC细胞增强干细胞特性，进而促进NSCLC转移[48]。研究证明，TGFb-1能够诱导原始NSCLC细胞发生EMT，并使NSCLC细胞获得间叶细胞表型和干细胞表面标志物（如Oct4、Nanog、Sox2和CD133）的表达，提示LCSC与EMT有着密切的关系[49]。Li等[50]设计了一种新的双特异性抗体BsAb-5，该抗体可以特异性靶向CD166+LCSC中的细胞间充质-上皮转化（cellular-mesenchymal to epithelial transition，c-MET）和细胞毒T淋巴细胞相关抗原4（cytotoxic T lymphocyte associated antigen-4，CTLA-4），使c-MET-Notch通路受到抑制，从而使小鼠移植瘤的体积缩小。③针对LCSC标志物的靶向治疗。有研究发现，使用三氟拉嗪处理LCSC会使NSCLC肿瘤球的形成受到抑制，同时下调了LCSC标志物（CD44/CD133）的表达；进一步研究发现，三氟拉嗪与吉非替尼或顺铂联合使用可有效抑制LCSC的耐药，提示可以通过LCSC标志物靶向杀伤LCSC[51]。另一项研究发现，麦角黄酮酸D（secalonic acid D，SAD）可以通过激活钙蛋白酶1（calpain1）缩短ABCG2蛋白的半衰期，从而减少NSCLC细胞中SP细胞的百分比，使ABCG2的表达下调，提示SAD可以作为靶向杀伤CSC的药物[52]。此外，Huang等[53]利用 CD133适配体（M-Gef-CD133）构建负载吉非替尼的DSPE-PEG2000纳米微囊，靶向肺CSC，使CD133+的LCSC比例减少，抑制了肺CSC肿瘤球的形成。④阻断LCSC相关信号通路。You等[54]研究发现，使用Wnt-2蛋白N末端的单克隆抗体（mAb）可使高表达Wnt-2的NSCLC细胞株（A549细胞系）凋亡。Ma等[55]使用特异的siRNA阻断Notch3通路，结果发现，NSCLC细胞中干细胞样性质的肿瘤球的形成比例减少，提示阻断Notch通路可杀灭LCSC。此外，Li等[56]在肺腺癌细胞中通过使用Hedgehog信号通路抑制剂——维莫德吉（vismodegib/GDC-0449）阻断信号转导通路，进一步干扰肿瘤细胞发生EMT，从而抑制肺腺癌细胞的侵袭和转移。⑤LCSC可作为抗肿瘤疫苗。Kooreman等[57]发现，将处理后的诱导性多能干细胞（induced pluripotent stem cell，iPSC）与免疫增强分子CpG相结合制备成疫苗，接种至实验组小鼠身上，发现接受干细胞疫苗的小鼠肿瘤缩小或消失，而对照组注射干细胞疫苗几周后肿瘤体积变大，提示干细胞疫苗发挥了抗肿瘤的作用，可能预防肿瘤的发生。

6 小结与展望

目前，LCSC是肺癌研究中的趋势和热点，尽管临床对LCSC进行了广泛的研究，但仍存在许多问题亟待解决：①LCSC标志物的发现对于肺癌的早期诊断、鉴别及治疗均具有重要的作用，但是目前缺乏能够鉴别和鉴定LCSC的特异性分子标志物，仍需进一步发现；②LCSC的相关调控机制尚未阐述清楚，深入研究LCSC相关信号通路以及关键调控基因的作用，能够更好地了解LCSC在肺癌发生、发展中的作用；③针对已知的LCSC表面标志物或LCSC相关信号通路，分子靶向治疗的效果还有限，仍需通过深入了解从而提高靶向治疗效果。因此，在肺癌的治疗方面，针对LCSC的靶向治疗策略具有广阔的前景，应进行深入研究和探索。