4种维生素对黑木耳锁状联合菌丝形成的影响

董锡文，朱德旋，杜春梅*，姜忠元，韩 笑，张 宇

(1.佳木斯大学生命科学学院，黑龙江佳木斯 154007；2.佳木斯大学应用微生物研究所，黑龙江佳木斯 154007；3.佳木斯大学教育科学学院，黑龙江佳木斯 154007)

黑木耳[Aurieuzariaauricular(L.ex Hook.)Uzderw.]是世界上最早实现人工栽培的食用菌，其食用和药用价值极高，深受消费者的普遍欢迎[1]。关于黑木耳生长研究已有很多[2-6]。有关黑木耳锁状联合形成的研究也逐渐受到重视[7-8]，形成锁状联合的菌丝再形成耳基的比例为100%，而不形成锁状联合的菌丝形成耳基的比例仅为20%左右，且形成锁状联合的菌丝形成耳基的时间比不形成锁状联合的菌丝形成耳基的时间提前30 d左右。这说明形成锁状联合的菌丝在形成黑木耳产量和降低生产成本方面具有重要影响，研究维生素对黑木耳锁状联合菌丝形成的影响将会对实际生产，尤其是生产效益具有重要意义。

1 材料与方法

1.1试验材料

1.1.1菌株。黑木耳黑29购于黑龙江省微生物研究所。

1.1.2试剂。维生素B1片(山东仁和堂药业有限公司)；维生素B2片(东北制药集团沈阳第一制药有限公司)；维生素B12片(上海信谊九福药业有限公司)；维生素C片(山西国润制药有限公司)；葡萄糖(分析纯，天津市北方天医化学试剂厂)；琼脂粉(生物试剂，北京奥博星生物技术有限责任公司)。

1.1.3培养基。基础培养基(PDA培养基)：马铃薯200 g，葡萄糖20 g，琼脂18 g，水1 000 mL，pH 6.0。维生素培养基：在基础培养基中加入不同浓度维生素，包括VB1培养基、VB2培养基、VB12培养基和VC培养基，pH 6.0。

1.1.4主要仪器与设备。MP1002电子天平(上海舜宇恒平科学仪器有限公司)；恒温培养箱(上海福玛实验设备有限公司)；光学显微镜(北京泰克仪器有限公司)；LDZX-75KBS立式压力蒸汽灭菌器(上海申安医疗器械厂)；移液枪(Thermo Scientific公司)。

1.2试验方法

1.2.1维生素母液的配制。将4种维生素制备成适当浓度的母液，用45 μm细菌滤膜进行过滤除菌，4 ℃冰箱储存备用。

1.2.2培养基的制备。基础培养基按照常规方法进行。维生素培养基采用基本培养基加维生素法，用移液枪吸取不同体积的4种维生素母液加入到基本培养基中，混匀倒平板，每种维生素终浓度分别为0、0.05、0.10、0.15、0.20、0.25和0.30 μg/mL。

1.2.3菌种活化与扩大培养。在25 ℃恒温培养箱中对黑29进行活化培养4 h后，在无菌条件下用接种铲将斜面菌种转接至基础培养基上进行扩大培养，待长势良好后进行后续试验。

1.2.4单因素试验。在扩大培养的黑29菌落周边选取直径0.86 cm健壮菌丝块，接种至维生素培养基平板中央，在距接种块2 cm处以45°角进行插片处理，每个平板插3个盖玻片。每个变量设3个重复，以无维生素的基本培养基为空白对照。

1.2.5正交试验。根据单因素试验结果，选取最佳的3个维生素浓度，采用L9(34)正交试验因素水平表对黑29锁状联合菌丝形成所需维生素含量进行优化试验，每个组合设3个平行。

1.3测定项目与方法待黑29菌丝长满盖玻片，置于10×40倍显微镜下观察记录菌丝数、锁状联合菌丝数并计算锁状联合菌丝比率。锁状联合菌丝比率=锁状联合菌丝数/菌丝数×100%。

1.4数据分析试验数据采用SPSS 17.0和Excel进行统计分析与做图。

2 结果与分析

2.1单因素试验结果从图1可以看出，在试验浓度范围内，随着4种维生素浓度的升高，黑29锁状联合菌丝平均比率先升高后降低。当VB1和VB12浓度分别为0.25和0.15 μg/mL时，锁状联合菌丝平均比率最高分别为76.33%和80.97%，比对照菌株分别提高了37.04%和45.37%。VC培养基对锁状联合菌丝平均比率影响最大，当VC浓度为0.15 μg/mL时，该比率高达90.60%，比对照菌株提高了62.66%；VB2培养基对该比率影响最小，当VB2浓度为0.20 μg/mL时，该比率为67.83%，比对照菌株提高了近21.78%。因此，单因素试验中可以确定不同维生素的最佳浓度。即VB1浓度为0.25 μg/mL、VB2浓度为0.20 μg/mL、VB12和VC浓度为0.15 μg/mL。

图1 不同种类浓度维生素对黑29锁状联合菌丝比率的影响Fig.1 The effect of different kinds and concentrations vitamin on ratios of hyphal clamp connection in H29

2.2正交试验结果将单因素试验最佳结果应用于正交试验，维生素浓度正交试验因素水平见表1，正交试验结果见表2。从表2可以看出，影响黑29锁状联合菌丝比率的主次因素依次是D、A、B、C，即VC是主要影响因子，VB1、VB2和VB12次之。方差分析结果表明，仅有D因素即VC在α=0.05水平上对锁状联合菌丝比率的影响存在显著差异，因此，在黑木耳菌丝生长培养基中首先考虑的是添加VC。经验证试验后等综合方面考虑，维生素的添加最佳方案为D3A3B2C1，即VC0.18 μg/mL、VB10.28 μg/mL、VB20.20 μg/mL、VB120.12 μg/mL。

表1 正交试验因素水平

表2 正交试验结果

注：同列不同小写字母表示不同组合间差异显著(P<0.05)

Note：Different lowercases in the same column stand for significant differences between different combinations at 0.05 level

3 结论与讨论

黑木耳菌丝的生长需要大量的碳源和氮源，不同碳源和氮源对菌丝生长有一定的影响[9-10]。赵萍[5]研究表明，适宜浓度的氨基酸(除酪氨酸)对黑木耳菌丝生长有促进作用，高浓度有抑制作用。而作为生长因子的维生素对黑木耳菌丝形成锁状联合的研究很少。该研究发现，适宜浓度的VB1、VB2、VB12和VC对黑木耳菌丝形成锁状联合均有促进作用，这也是生长因子促进菌丝生长的一个重要表现，与其他研究者关于维生素对食用菌菌丝生长影响的研究结果一致[11-13]。

通过正交试验可以看出，多生长因子的加入对黑木耳锁状联合形成有促进作用，锁状联合菌丝比率达94.43%，高于单因子的作用，但作用效果不同。方差分析结果表明，在多因子作用中，只有VC作用效果显著，VB1、VB2、VB12的效果未达到显著水平，多种维生素加入的组合是VB10.28 μg/mL、VB20.20 μg/mL、VB120.12 μg/mL、VC0.18 μg/mL。因此，在黑木耳菌种制备过程中有必要考虑加入适量的维生素，以利于提高黑木耳子实体的产量。