禽流感病毒实时荧光定量RT-PCR检测方法的建立

王楷宬，王素春，朱 琳，仲焕香，黄保续

（1. 中国动物卫生与流行病学中心，山东青岛 266032；2. 南京农业大学，江苏南京 210095）

禽流感病毒（Avian influenza virus，AIV）为单股负链RNA病毒，由 8个独立的RNA节段组成。该病毒的显著生物学特征之一是亚型众多、变异频繁。迄今为止从禽类体内已经分离到上千种毒力各异的毒株，根据病毒粒子表面的血凝素（HA）和神经氨酸酶（NA）的抗原性差异，将其分为18种HA亚型（H1～H18）和11种 NA 亚型（N1～N11）[1-3]。

禽流感分布很广，世界各地均有分离出该病病原的报道。其病原致病性有高致病性和低致病性之分。禽流感的发生给养禽业造成严重危害。据联合国粮农组织（FAO）报告，2003—2004年禽流感在越南暴发导致的损失预计为该国GDP的0.3%～1.8%[4]。禽流感暴发对我国家禽养殖农户的生计也造成了巨大冲击，农户家禽养殖收入和家庭收入均显著下降。在控制其他变量的条件下，1次禽流感发生会造成农户人均家禽养殖收入平均降低65%，农民人均收入下降29%[5]。

同亚型毒株对宿主的致病力差异显著。在所有HA亚型中，只有H5和H7亚型对禽是高致病性的，称为高致病性禽流感（High pathogenic avian in fluenza，HPAI）。该类病毒可引起鸡群100%死亡，因而HPAI被世界动物卫生组织（OIE）列为须通报动物疫病。此外，禽流感的危害不仅是对养禽业的破坏，还对人类健康构成潜在威胁[6-7]。

快速检测是有效防控动物和人类禽流感的关键因素之一。为满足AIV的高通快速检测与应急响应，本研究建立了AIV实时荧光定量RT-PCR检测方法，评估了该方法的检测下限与特异性，并进行了临床应用检测。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

Qubit核酸浓度测定仪及配套试剂：均购自Life technologies公司；超净工作台：美国Forma Scientific公司产品；移液器：Eppendorf公司产品；孵化器：德州诚信孵化设备有限公司产品；高速台式离心机：德国Heraeus Biofuge primoR公司产品；荧光定量PCR仪：Bio-Rad CFX96 Realtime PCR System；PrimeScriptTMOne Step RT-PCR Kit（Perfect Real Time）、Primescript One step RTPCR Kit Ver.2：宝生物工程（大连）有限公司产品；QIAamp Viral RNA Mini Kit核酸提取试剂盒：德国QIAGEN公司产品；Low-Pro file PCR Tubes 8-tube strip：BIO-RAD公 司 产 品；Optically clear flat 8 Cap Strips：Thermo Scientific公司产品；异丙醇、无水乙醇、RNaseA等：均为国产分析纯试剂。

1.2 毒株与核酸提取

各亚型流感病毒、新城疫病毒（Newcastle disease virus，NDV）、传染性支气管炎病毒（Infectious bronchitis virus，IBV）、 传 染 性 喉气 管 炎 病 毒（Infectious laryngotracheitis virus，ILTV）毒株：由中国动物卫生与流行病学中心禽病监测室保存，毒株详细信息见表1。按照说明书操作，使用QIAamp Viral RNA Mini Kit提取病毒RNA，并使用Qubit核酸浓度测定仪及配套试剂测定RNA浓度。

1.3 引物与探针筛选

从GenBank中下载不同亚型、不同国家、不同分离时间的AIV毒株M基因序列共1 641条，采用MEGA 6.0[8-9]进行序列比对，选取保守区域进行荧光定量检测引物和探针设计，并对多条引物、探针进行组合、筛选与检验，以期筛选出最优引物和探针。

1.4 反应体系与反应条件

配制荧光定量RT-PCR反应液，每管25 μL：含 2×One Step RT-PCR Buffer Ⅲ 12.5 μL，5 U/μL TaKaRa Ex Taq HS 0.5 μL，PrimeScript RT Enzyme Mix Ⅱ 0.5 μL，10 pmol/μL M forward、M reverse和 M probe 各 0.5 μL，RNase Free dH2O 8.0 μL，待检测样品RNA模板2 μL。将检测反应条件设置为：第1阶段，42 ℃/5 min；第2阶段，95 ℃/10 s；第3阶段，95 ℃/5 s，60 ℃/20 s（收集荧光），40个循环。无Ct值并且无扩增曲线时，样品判为阴性；Ct值≤36，且出现典型的扩增曲线，样品判为阳性。

1.5 特异性与灵敏度评估

采用上述反应体系与反应条件，检测表1中的病毒RNA，以评估该检测方法的特异性。提取的核酸经Qubit核酸浓度测定仪测定RNA浓度后，将此病毒RNA稀释成1 ng/μL，再10倍梯度稀释成 10-1～10-6ng/μL；分别取 2 μL 作为反应模板，按照前述加样方法进行实时荧光定量RT-PCR核酸扩增。

表1 禽流感病毒毒株信息

1.6 临床样品检测

采集我国华东某市4个养鸡场的鸡咽喉拭子共94份，置于含有10%甘油和抗生素（含青霉素2 000 IU/mL、链霉素2 000 IU/mL、制霉菌素1 000 IU/mL，BSA 5 mg/mL） 的 PBS（pH7.2）缓冲液中，-80 ℃保存。将采集的样品涡旋混匀后，4 ℃ 10 000 r/min离心5 min；取上清，使用QIAamp Viral RNA Mini Kit提取病毒核酸[10]，-80 ℃保存。使用96孔反应管加入上述反应体系，分别加入待检样品RNA进行检测。用该方法与农业行业标准《禽流感病毒RT-PCR检测方法》（NY/T772—2013）中的方法，同时对94份临床样品进行检测，对比检测结果，分析本试验建立方法在临床检测中的适用性。

2 结果与分析

2.1 引物与探针筛选

最终筛选出最适合的引物（M forward、M reverse）和探针（M probe），序列已申请发明专利（表2），其中M probe为TaqMan荧光探针，标记ROX荧光。

表2 最适引物及探针序列

2.2 特异性与灵敏度

结果显示，除了各亚型AIV RNA模板对应的试验组出现了正常荧光检测曲线外，其他非特异性病毒的试验组及阴性对照组均未出现扩增曲线。结果表明，此方法不与其他相关病毒发生交叉反应，可以实现AIV的特异性检测（图1）。

本研究筛选的引物和探针组合能够保证检测时的灵敏性，检测灵敏度为RNA终浓度10-4ng/μL（图2）。

图1 AIV实时荧光定量RT-PCR检测特异性试验结果

图2 AIV实时荧光定量RT-PCR检测灵敏度试验结果

2.3 临床样品检测

用本试验建立的AIV实时荧光定量RT-PCR检测方法和农业行业标准NY/T772—2013中的传统检测方法，对94份临床样品进行检测，发现两种检测方法结果一致，阳性符合率为100%（表3）。共检测96份样品，其中94份临床拭子样品、1个AIV阳性对照、1个AIV阴性对照，而本试验建立的实时荧光定量RT-PCR检测方法耗时约1 h。部分检测结果见图3。

3 讨论

实时荧光定量PCR（quantitative real-time PCR）是在PCR定性技术基础上发展起来的核酸定量技术。它是一种在PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号积累，实时监测整个PCR进程，最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析的方法。该技术不仅实现了对DNA模板的定量，而且灵敏度高，特异性和可靠性更强，能实现多重反应，自动化程度高，无污染性，同时具有实时性和准确性的优点，目前已广泛应用于分子生物学研究和医学研究等领域[11]。

本研究在分析大量AIV流行毒株序列基础上，筛选出一组特异性好、检测下限达10-4ng/μL的探针、引物，建立了高通量检测方法，并应用于临床检测。该方法能够检测各亚型AIV，与农业行业标准NY/T772—2013中的传统方法进行对比试验，发现阳性符合率达100%，且能在1 h内完成对未经培养临床样品的高通量检测，能够满足大规模流行病学调查的需要。

表3 临床样品检测结果

图3 部分临床样品实时荧光定量RT-PCR检测结果

近年来，实时荧光定量RT-PCR检测已逐渐使用TaqMan荧光探针代替SYBR Green染色，使用TaqMan荧光探针，较传统SYBR Green染色法，可避免污染并且能够提高特异性。目前关于检测所有亚型AIV的TaqMan实时荧光定量RT-PCR检测方法的报道较少。Nagy等[12]曾建立一种使用TaqMan荧光探针的AIV实时荧光定量RT-PCR检测方法，其检测下限能够达到5拷贝/反应，也能达到良好的检测效果。本研究使用TaqMan荧光探针，检测灵敏度也达到了10-4ng/μL，特异性也较好。

流感病毒曾在20世纪引起4次疫病大流行，包括1957年的H2N2、1968年的H3N2以及1918年和2009年的H1N1，导致数百万人死亡。1997年暴发的H5N1禽流感疫情造成18人感染、6人死亡，这也是全球首次发现AIV能够传染给人[13]。我国被认为是容易产生新型流感病毒的区域[14]。新型或变异AIV目前在我国广泛存在，有些甚至会导致人类感染，如H5N1、H6N1、H7N9、H9N2、H10N8和H5N6等[15]。因此，建立能检测所有亚型AIV的检测方法有利于及时发现这些变异和新型AIV毒株。