囊型包虫病患者Th9细胞相关因子mRNA表达特点研究*

陈 媛，庞楠楠，赵 骁，赵 慧，安梦婷，闫 芳，张峰波，丁剑冰△

(1.新疆医科大学基础医学院，新疆乌鲁木齐 830011；2.乌鲁木齐市中医医院检验科，新疆乌鲁木齐 830000)

包虫病主要由两种绦虫可引发人包虫病：细粒棘球绦虫(Eg)引发人囊型包虫病(CE)，多房棘球绦虫(Em)引发人泡型包虫病(AE)[1]。在中国，以上两种类型包虫病的患病率在全球属于最高水平，在国内主要分布于西北五省、西藏、四川等地，新疆是高发区之一。

2008 年VELDHOEN等[2]和DARDALHON等[3]同时报道了在白细胞介素(IL)-4和转化生长因子(TGF)-β同时存在的情况下可诱导初始CD4+T 细胞分泌IL-9、IL-10，并将之命名为“Th9”细胞。Th9细胞主要分泌IL-9和IL-10细胞因子，且有其特异的转录因子富含嘌呤盒1(PU.1)和干扰素调节因子-4(IRF-4)[4-6]。作为新型辅助性T细胞，Th9在大量动物实验及在人体内作用的研究已成为近年热点，但Th9细胞相关因子在囊型包虫病患者疾病的发生发展过程中的具体机制尚不清楚。本研究拟通过检测CE患者外周血中IL-9、PU.1、IRF-4和IL-4 mRNA表达水平，初步探讨Th9细胞相关因子在细粒棘球蚴感染后机体免疫应答中所起可能作用。

1 资料与方法

1.1一般资料 采集2015年8月至2017年8月在新疆医科大学第一附属医院就医和入院的与纳入标准相符的CE患者33例作为CE组，且这33例CE患者就诊前未接受任何治疗，其中男性19 例，女性14 例，年龄19～58 岁，中位年龄30岁；对这33例CE患者经过外科手术和阿苯达唑药物治疗，跟踪6个月，通过影像学检查未发现复发和转移，且没有明显感染症状的33例CE患者作为治疗后组(PCE组)；30例性别、年龄与患者相匹配新疆医科大学第一附属医院的体检健康的员工作为健康对照组(HC组)。纳入标准：按照包虫病诊断标准并通过患者病史、影像学检查以及体格检查确诊为囊型包虫病的患者，并经手术、病理检查证实。排除标准：使用抗炎药；合并其他疾病的患者，如急慢性病毒感染、自身免疫性疾病、肿瘤、风湿性疾病、脓毒血症、严重上呼吸道感染、高热、胆囊炎、肺炎、其他寄生虫疾病等。

1.2仪器与试剂 总RNA 提取试剂盒购自 Qaigen 公司，逆转录反应试剂盒购自SYBER GREEN公司，实时定量试剂盒购自 TaKaRa公司 ；实时荧光定量PCR仪；电泳仪及凝胶自动成像系统、xMark全波长酶标仪均购自美国Bio-Rad公司。

1.3方法

1.3.1引物设计 按照Gen Bank 中人 β-actin、 IL-9、PU.1、IRF-4和IL-4 mRNA引物序列，以β-actin作为参照基因，全部引物均由大连宝生物工程有限公司合成，引物基本信息详见表1。

表1 引物序列及扩增长度

1.3.2总RNA的提取和cDNA的合成 于早晨用枸橼酸钠抗凝管采集每位研究对象空腹静脉血5 mL。外周血总RNA的提取按照Qaigen 公司提供的试剂盒说明书进行，从每个外周血标本中取 1 μg 总RNA作为模板，然后在依据SYBER GREEN公司的反转录试剂盒说明书逆转录合成cDNA。

1.3.3实时荧光定量PCR(QRT-PCR)检测IL-9、PU.1、IRF-4、IL-4 mRNA表达 依据TaKaRa 公司的实时定量试剂盒说明书在冰上配制PCR 反应液，每一个样本重复3 次，待反应结束后得到一条荧光扩增曲线及溶解曲线。使用标准品已知起始拷贝数的对数值作为横坐标，以测得的循环阈值(Ct)作为纵坐标，做出标准曲线。将β-actin作为参照基因，选用2-ΔΔCt相对定量法来确定特定荧光域值对应循环数的 Ct 值，对目标基因定量，来分析对比各组中IL-9、PU.1、IRF-4、IL-4 mRNA基因表达差异。

2 结 果

2.1IL-9 mRNA在HC组、CE组及PCE组外周血中的相对表达水平 CE 组IL-9 mRNA的表达水平(0.098±0.044)明显高于HC组(0.075±0.038)，差异有统计学意义(P<0.05),稍高于PCE组(0.078±0.044)，差异无统计学意义(P>0.05)，IL-9 mRNA在PCE组和HC组的表达比较，差异无统计学意义(P>0.05)。见图1。

注：与HC组比较，aP<0.05

图1 IL-9 mRNA在HC组、CE组及PCE组中相对表达量

2.2PU.1 mRNA在HC组、CE组及PCE组外周血中的相对表达水平 CE 组 PU.1 mRNA的表达水平(0.104±0.067)明显高于HC组(0.052±0.008)，差异有统计学意义(P<0.05)，且明显高于PCE组(0.065±0.035)，差异有统计学意义(P<0.05),PU.1 mRNA在PCE组和HC组的表达没有明显差异(P>0.05)。见图2。

注：与HC组比较，dP<0.01 ；与CE组比较，bP<0.05

图2 PU.1 mRNA在HC组、CE组及PCE组中相对表达量

2.3IRF-4 mRNA在HC组、CE组及PCE组外周血中的相对表达水平 IRF-4mRNA在CE组(0.070±0.020)和PCE组(0.067±0.018)的表达较HC组(0.060±0.013)增高不明显，差异无统计学意义(P>0.05)，且IRF-4mRNA在CE、HC组、PCE组的表达水平没有明显的差异(P>0.05)。见图3。

图3 IRF-4mRNA在HC组、CE组及PCE组中相对表达量

2.4IL-4 mRNA在HC组、CE组及PCE组外周血中的相对表达水平 IL-4是CD4+T细胞亚群分化为Th9细胞亚群的重要的上游刺激因子，IL-4mRNA在CE组的表达水平(1.053±0.317)明显高于HC组(0.125±0.03)和PCE组(0.53±0.047)，差异均有统计学意义(P<0.05)。见图4。

注：与HC组比较，dP<0.01；与PCE组比较，eP<0.01

图4 IL-4mRNA在HC组、CE组及CE组中相对表达量

注：A为IL-9 mRNA和PU.1 mRNA相对表达量之间的相关性；B为IL-9 mRNA和IRF-4 mRNA相对表达量之间的相关性;C为IL-9 mRNA和IL-4mRNA相对表达量之间的相关性

图5 IL-9 mRNA和PU.1、IRF-4、IL-4 mRNA相关性分析

2.5IL-9 mRNA和PU.1、IRF-4、IL-4 mRNA相关性分析 为了探讨 IL-9和PU.1、IRF-4、IL-4 之间的关系，本研究用Spearman线性相关性分析法进行上述因子的相关性分析，结果显示，IL-9与转录因子PU.1、上游诱导因子IL-4mRNA均呈正相关(PU.1：r=0.974,P<0.000 1；IL-4：r=0.922,P<0.000 1)；IL-9与另一转录因子IRF-4 mRNA没有相关性(r=0.261，P=0.142)，见图5。

3 讨 论

细粒棘球蚴在宿主体内生长发育缓慢，可使机体出现炎性反应和免疫反应，感染初期的临床症状并不明显，感染数月乃至数年后才出现突出的临床症状[7]。人感染细粒棘球蚴后，宿主体内会发生一系列细胞免疫和体液免疫的变化，当前认为这些变化中最重要的是CD4+T 细胞亚群对机体感染免疫应答的调节过程。在大多数感染免疫中，许多研究都认为Th1/Th2起着重要的作用。有研究证实，感染细粒棘球蚴初期机体的免疫反应以Th1型细胞免疫为主，Th1细胞及其分泌的细胞因子有利于机体清除寄生虫，因此在包虫病感染免疫中对机体起到保护性作用；但在感染中晚期随着绦虫的寄生和其对宿主免疫的主动调节，宿主逐渐向Th2体液免疫反应类型转变。由于Th2细胞分泌的细胞因子对Th1细胞有抑制作用，可削弱宿主机体保护性免疫应答，从而使病原体逃避宿主免疫系统的攻击，有利于寄生虫在宿主体内继续寄生[8-9]。 之前认为Th1/Th2和Th17/Treg 平衡学说是包虫病的免疫学机制中的主要部分[10-12]，以前的研究中将IL-9归于Th2类细胞，其可作用于多种靶细胞，参与发病机制完全不同的疾病，如过敏性疾病、自身免疫性疾病、寄生虫感染等[13-15]。现有研究发现，IL-9是Th9细胞产生的，作为新型辅助性CD4+效应性T细胞，Th9细胞在许多疾病中发挥着重要的作用[4,16-17]，本课题组前期工作研究证实Th9/IL-9可能参与了细粒棘球蚴感染的免疫应答反应过程[18-20]。但在囊型包虫病中，Th9细胞因子mRNA水平上的表达特点研究尚处于空白，本研究显示IL-9 mRNA在囊型包虫病患者中的表达明显高于健康人群，但经过外科手术和药物治疗成功的患者IL-9 mRNA表达水平并没有显著减少。其结果提示在细粒棘球蚴感染机体后，寄生虫可能刺激宿主发生免疫应答反应并上调Th9细胞功能性细胞因子IL-9 mRNA表达，PCE组IL-9 mRNA表达水平变化特点的可能原因是其他IL-9转录因子开始生效或者在转录水平延迟表达，但其具体机制尚需进一步研究。

目前有研究证实，Th9细胞主要由两种途经产生：一是初始CD4+T细胞在体外IL-4和TGF-β联合刺激诱导下直接分化而来；另一个是在TGF-β单独作用下由Th2细胞转化产生[21]。在研究中，IL-4 mRNA在囊型包虫病患者外周血中的表达明显高于健康人群，而且治疗成功后其表达水平明显减少，与HC组没有统计学差异。此结果提示IL-4 作为Th9 细胞分化的上游因子可能参与CE患者的感染免疫途径并起到一定的作用并且可能是CE预后相关因子，IL-4可能会削弱Th1细胞在CE患者体内的保护性免疫机制并使寄生虫在体内继续存活。

PU.1、IRF-4是Th9细胞的特异性转录因子，其中PU.1作为ETS转录因子家族成员之一，可与IL-9 基因的启动子直接结合，诱导IL-9的表达，此过程在其他CD4+T细胞亚群中未见，仅见于Th9 细胞。体外培养实验证实，若小鼠PU.1缺乏，其IL-9表达也极少，如果Th9 细胞中PU.1 的表达上调，相应的IL-9表达也会增加。在本研究中也发现CE患者外周血中PU.1 mRNA的表达明显增加，同时在PCE组明显降低。而另一转录因子IRF-4 mRNA在CE患者外周血中的表达增加不明显，且治疗后PCE组变化也不明显，和HC组比较均没有明显差异。此结果提示转录因子PU.1在CE患者感染免疫过程中对Th9细胞分化增殖的调节起到一定的作用，而IRF-4可能在过程中没有明显的作用。

本研究中IL-9和PU.1、IRF-4、IL-4 mRNA相关性分析结果显示，IL-9与转录因子PU.1、IL-4之间存在明显的正相关关系，与另一转录因子IRF-4之间没有相关性。因此，随着Th2细胞发挥其在囊型包虫病中晚期主导作用，Th9/IL-9也可能在CE患者感染免疫的发生和发展过程中起一定的作用，PU.1、IL-4 mRNA在治疗后下降提示在寄生虫对机体的免疫刺激清除后，CE患者体内的感染免疫反应机制也可能发生改变。

4 结 论

本研究显示Th9细胞的相关因子IL-9、PU.1、IL-4 mRNA 在CE患者外周血中的表达显著上调，在治疗后PU.1、IL-4 mRNA表达水平基本恢复正常，提示Th9细胞可能参与了细粒棘球蚴感染过程中的免疫应答和调控机制。但是Th9细胞在囊型包虫病中的感染免疫的具体机制有待进一步明确。