基于分子条形码标记的超深度二代测序技术在儿童急性白血病微小残留病检测中的应用*

王明敏，肖剑文，雷小英，杨 山

(1.重庆医科大学附属儿童医院血液肿瘤中心，重庆 400014；2.重庆儿童医院儿科研究所，重庆 400014；3.儿童发育疾病研究教育部重点实验室，重庆 400014；4.儿科学重庆市重点实验室，重庆 400014；5.重庆市万盛开发区人民医院儿科，重庆 400800)

1 资料与方法

1.1一般资料 选取2017年9月至2018年11月重庆医科大学附属儿童医院血液科收治AL患儿35例。其中男性24例，女性11例，平均年龄(82.31±8.86)个月。所有患儿诊断时年龄均<18岁，且按照WHO-2016造血与淋巴组织肿瘤分类标准[5]完善检查确诊为AL。Burkitt白血病、继发性白血病、急性早幼粒细胞白血病、既往接受过抗白血病治疗、合并其它肿瘤性疾病及未能完成诱导缓解疗程患儿未纳入本研究。本研究获得重庆医科大学附属儿童医院伦理委员会批准，所有患儿家属均签署知情同意书。

1.2方法

1.2.1治疗方法 35例患儿中包括前体B-ALL(BP-ALL)22例、T-ALL 4例、AML 6例和MPAL 3例，MPAL均为B-ALL与AML双系列型。患儿均接受一个疗程诱导治疗并达到完全缓解(CR)：ALL及MPAL按照改良的St.Jude Total-XV-ALL方案[6]化疗，AML按照COG-AML方案[7]化疗。CR定义为[6-7]：1个疗程化疗结束，骨髓抑制解除，(1)临床上无明显出血、感染及白血病浸润表现；(2)血常规血红蛋白>90 g/L，血小板>100×109/L，白细胞正常或减低，分类无幼稚细胞；(3)骨髓细胞学提示增生活跃或明显活跃，且白血病细胞<5%。采集患儿初诊及诱导治疗结束后骨髓液进行检测，采集患儿父母外周血作为WES测序对照样本，若无法获取患儿父母样本则选择诱导治疗结束后患儿口腔黏膜刮片细胞作为对照样本。

1.2.2FCM-MRD检测 诊断时采集患儿EDTA抗凝骨髓液，利用8色流式细胞仪确定ALL、AML及MPAL患儿白血病相关免疫表型(LAIP)[8-9]。未能发现LAIP标记则均应用以下简易抗体组合[8-9]：B-ALL：CD19、CD10及CD3；T-ALL：CyCD3及TdT；AML：CD34、CD117、CD33、CD38、CD19、CD56、CD64、CD14及HLA-DR等。

诱导结束后，采集EDTA抗凝骨髓液2 mL并分离单个核细胞(MNC)，根据初治时LAIP选择个体化检测抗体组合或利用简易组合，使用流式细胞仪检测FCM-MRD。出现下述情况则定义为FCM-MRD阳性[8-9]：正常表达的抗原强度发生改变(增强或减弱)和/或丢失、异常表达其他系别标志、早期和晚期抗原同时表达、幼稚细胞明显增多且均质性表达等。以这些残存细胞占骨髓MNC总数比例作为MRD数值。ALL和AML分别以FCM-MRD<10-4和FCM-MRD<10-3为阴性[3,9]，MPAL分别记录ALL及AML细胞群FCM-MRD水平。

1.2.3PCR-MRD检测 诊断时采集患儿EDTA抗凝骨髓液，采用多重巢式RT-PCR(mutiplex RT-PCR)技术行29种白血病融合基因筛查[10]。ETV6/RUNX1、BCR/ABL、TCF3/PBX1、RUNX1/RUNXT1及CBFb/MYH11等常见基因阳性者采用实时荧光定量PCR(qRT-PCR)技术检测标本基因拷贝数、已知浓度标准品浓度，利用待测标本ABL浓度作为对照，得出待测标本基因拷贝数、基因拷贝数与ABL浓度比值[11]；MLL重排、SIL/TAL等少见基因阳性者则采用RT-PCR技术复核[11]。

融合基因阳性患儿诱导结束后，采集EDTA抗凝骨髓液分离MNC并提取细胞总RNA，逆转录为cDNA。上述常见融合基因采用qRT-PCR技术定量检测，基因拷贝数<10-4为PCR-MRD阴性[3]；少见融合基因阳性者采用RT-PCR技术定性检测，未见阳性条带为PCR-MRD阴性[3]。

1.2.4WES、标记选择及NGS-MRD检测 采集患儿诊断时EDTA抗凝骨髓液并收集对照样本，使用QIAamp DNA Blood MiniKit(Qiagen)试剂盒提取基因组DNA，操作按照试剂盒说明书进行。1%琼脂糖凝胶电泳和Nanodrop 2000分光光度计进行基因组DNA定量检测，OD260/OD280值1.6～1.8为合格样本，-20 ℃保存。

当然，今天的我们都知道了，美国与其他一些西方发达国家虽然确实也曾遭遇环境保护方面的一些问题，但是，诸如瓶装水、管道空气之类无疑是误解：瓶装水或许是可乐与纯净水；而管道空气或许与“氧吧”之类东西有关。它也可能是一种夸张，为了诠释某种观点而演绎出来的类似今天的段子的“故事”。

WES测序委托上海新培晶医学检验所完成，平均测序深度150～200×。用Illumina Pipeline software(version1.3.4)读出原始测序数据，采用本课题组前期建立的方法进行数据信息处理及生物信息学分析，明确致病基因突变位点并采用Sanger测序进行突变位点鉴定[12]。检测结果与对照样本进行比较，排除肿瘤遗传易感基因突变。选择突变率与初诊时FCM检测到的白血病细胞比例相当的体细胞基因突变作为MRD监测的标记物，若符合条件的肿瘤基因突变>5种时，选择突变频率最高的5种作为NGS-MRD检测的标记。

NGS-MRD检测委托北京全谱医学检验实验室完成，流程大致为[13-14]：按照qPCR引物要求设计引物，引物设计完成后，分别在上下游引物5′端添加tag序列(示例引物：上游引物：CGCTCTTCCGATCTacggccagtNNNNNN；下游引物：CGCTCTTCCGATCTactataggg NNNNNN)，其中NNNNNN为随机引物。诱导治疗结束后采集EDTA抗凝骨髓液并提取300 μL 基因组DNA，尽量减少洗脱体积增加浓度并进行PCR扩增。PCR扩增产物使用hiseq2500测序仪器上机测序后，经bcl2fastq-2.20转化得到原始fastq序列文件，通过fastp(版本：v0.18.1，参数：-w 6 -l 50 -U --umi_loc per_read --umi_len 15)识别UMI并过滤原始fastq、得到带有UMI标记的clean fastq并进行突变分析并记录基因突变率，测序深度≥200 000×。突变率<0.001%为阴性；若2种及以上基因突变率≥0.001%时以中位值作为NGS-MRD检测结果。

2 结 果

2.1FCM-MRD结果 35例患儿BP-ALL及AML各有1例未找到LAIP，FCM-MRD检测标记的检出率93.94%。诱导治疗后35例均进行FCM-MRD检测，3例BP-ALL和2例MAPL阳性，阳性检出率14.29%。FCM-MRD阳性BP-ALL定量结果分别为0.30%、0.05%和0.09%；FCM-MRD阳性MAPL均AML标记阴性，ALL标记分别为0.13%和5.05%。

2.2PCR-MRD结果 35例患儿中10例检出白血病融合基因，PCR-MRD检测标记的检出率为28.57%，分别有5例BP-ALL(TCF3-PBX1 2例，ZM1Z1-ABL、ETV6-RUNX1及MLL/AF9各1例)、1例T-ALL(SIL/TAL)、3例AML(RUNX1/RUNXT1 2例，CBFb/MYH11 1例)和1例MAPL(BCR/ABL)融合基因阳性。诱导治疗结束后对10例初诊融合基因阳性患儿进行PCR-MRD检测，2例初诊RUNX1/RUNXT1阳性AML患儿PCR-MRD阳性，阳性率20%，其融合基因相对表达值分别为0.59和0.004。

2.3NGS-MRD结果 35例初诊时筛选到1～7个不同的体细胞肿瘤基因突变致病位点，包括KIT、KRAS、NRAS、KMT2B、FLT3、ATM、FBXW7、NOTCH1、IKZF3等，平均检出致病突变(3.03±0.27)个。以上述突变作为NGS-MRD检测标记，检测标记的检出率为100%。诱导治疗后，35例均行NGS-MRD检测，20例结果为阳性，阳性率57.14%，阳性病例包括B-ALL 9例、T-ALL 2例、AML 6例及MPAL 3例。

2.43种MRD检测方法比较 3种不同方法进行MRD标记筛选，NGS-MRD标记检出率最高(100%)，其次为FCM-MRD(93.94%)，而PCR-MRD标记检出率最低(28.57%)，其阳性率比较，差异有统计学意义(P<0.05)。同时对FCM、PCR及NGS标记10例诱导治疗后MRD水平进行比较，其灵敏度仍以NGS-MRD方法最高(阳性率60%)，差异有统计学意义(P<0.05)，见表1。5例FCM-MRD阳性及2例PCR-MRD阳性患儿其NGS-MRD检测结果均为阳性，见表2。

表1 3种MRD检测方法的标记筛选及MRD检测结果

注：*表示PCR筛选仅10例有阳性标记

表2 3种MRD检测方法比较阳性结果比较

注：-表示无数据；MPAL的FCM-MRD结果为ALL细胞群；negative表示阴性

35例FCM-MRD检测结果平均值为(0.016±0.014)%，NGS-MRD检测结果平均值为(0.068±0.033)%，进行配对比较，差异无统计学意义(P=0.084)；如果按照ALL及AML进行分组比较，差异无统计学意义(ALL：P=0.050；AML：P=0.190)；MPAL组因样本量较小未作分析。以上结果提示NGS-MRD方法的特异性可能不低于其它两种检测方法，见图1。

图1 FCM-MRD及NGS-MRD检测结果

3 讨 论

AL是儿童期最常见的恶性肿瘤，年发病率4/10万～6/10万，严重威胁儿童生命[1]。随着诊疗技术进步，儿童AL疗效得到不断提高，但终究有部分患儿疾病复发并导致死亡。目前认为，治疗达到CR 后患儿体内仍剩余微量白血病细胞是导致疾病复发的重要因素[15]。因此，寻找可靠的指标用于检测AL患儿治疗后MRD水平对于指导AL治疗方案调整非常重要。

目前最为常用的MRD检测方法包括：(1)FCM-MRD：即利用FCM确定患儿初诊LAIP，治疗中定期定量随访其表达水平[8-9]。该方法方便快捷，灵敏度达到0.001%，是临床最常用的MRD检测方法。但部分AL患儿无法找到合适检测标记，只能使用简易标记检测MRD，检查误差较大，本研究的35例患儿中有2例未找到合适标记；由于治疗后白血病细胞表面的抗原漂移等原因，随着化疗时间延长，FCM-MRD检测误差也不断增加；APL等部分AL亚型无法使用FCM检测MRD水平；对于接受异基因造血干细胞移植、CAR-T疗法等患儿细胞表面抗原发生改变[15-16]，难以应用FCM检测MRD；FCM-MRD灵敏度为10-3～10-4，相对较低；FCM-MRD方法受到检测单位技术影响，且难以复核。(2)PCR-MRD：初诊时利用PCR技术检测患儿存在的白血病融合基因、治疗后定期随访其基因表达情况[3]。该方法灵敏度可达10-5且特异性强，不受治疗影响；PCR技术检测到的融合基因类别还可以用于指导诊疗方案调整。因此，长期随访检测时PCR-MRD技术可能好于FCM-MRD技术[3]。但文献报道及本课题组前期研究均显示，即使采用mutiplex RT-PCR技术进行白血病融合基因检测，仍然有超过50%的AL患儿初诊时白血病融合基因检测阴性[4-5]，不能用该方案检测MRD；对于常见的融合基因可以采用qRT-PCR技术定量检测并客观有效地指导治疗方案调整，而少见的融合基因型则只能采用RT-PCR技术定性检测[11]。因此，需要寻找其它灵敏度高、特异性强的方法用于AL患儿MRD检测。

各种原因诱发DNA损伤并导致的肿瘤基因突变是白血病细胞特异性的标记，全外显子组是人类全部外显子组区域的总称，是致病突变最为集中的区域，如果使用NGS技术对初诊AL患儿进行WES测序，理论上所有的白血病患儿都能发现肿瘤细胞基因突变[17]，本研究中35例患儿均检测到1～7种体细胞肿瘤基因突变。病初检测到的体细胞肿瘤基因突变系白血病细胞突变所致，因此，我们设想将发现的基因突变作为分子标记，治疗后定量随访其突变比例可能是一种灵敏度和特异度均较高的MRD检测方法。但每个AL患儿基因突变类别存在较大差异，本组患儿初诊时筛选到1～7个不同的基因突变位点，若对每种突变都采用RT-PCR技术进行PCR-MRD检测，则需要设计大量不同的引物和多次反复检测，耗时费力且成本高、质控也难以进行，并不适用于临床。治疗后患儿的白血病细胞及其基因突变比例均非常低，如果使用NGS测序检测突变比例则需要超高深度进行检测，即SD-NGS测序[16]。但NGS测序的文库构建、目标区域捕获过程中都涉及到DNA聚合酶和扩增，这样会引入一些原始样本基因组上并不存在的错误以及扩增的偏好性[17]；测序环节则取决于不同的测序读长、base calling算法及检测的突变类型等，它的测序错误率可达1-0.05%[18]。这些系统错误，使得人们利用SD-NGS测序技术检测低频突变时，难以区分到底是真实的样本突变还是由于这些系统错误所造成的假阳性。因此，直接进行SD-NGS测序检测MRD的假阳性概率明显增加，使用显著受限。

UMI又称分子条形码或分子标签[19]，是对原始样本基因组打断后的每一个片段都加上一段特有的标签序列，经文库构建及PCR扩增后一起进行测序。UMI通常由10 nt左右随机序列或简并碱基组成。有别于样品标签。UMI是针对同一个样本中的不同片段加上的标签序列，而样品标签是用于区分不同样本而加上的标签序列，每一个样本只有一个相同的样品标签，但可以有成千上万的分子条形码[20]。这样，根据不同标签序列就可以区分同一样本中成千上万不同的片段，在后续数据分析中可以通过这些标签序列来排除系统错误，分辨哪些是PCR扩增及测序过程中的随机错误造成的假阳性突变，哪些是患者真正携带的突变，从而提高检测的灵敏度和特异度[18]。以本研究示范的上游引物为例，整个引物序列分为以下几个部分：(1)CGCTCTTCCGATCT：为每个目的基因都专门设计的一个标签序列，随着PCR扩增后可以作为样品标签区分不同的目的基因；(2)acggccagt：系目的基因的上游引物，PCR扩增的目的基因序列；(3)NNNNNN：随机引物，评估扩增后是否发生随机错误。

目前广泛应用的NGS测序技术的特点是广覆盖和测序深度较低，可以较好地检出高频突变，但频率较低尤其是突变率低于1%的时候误差较大。而UMI标记的NGS技术的优点在于可以同时兼顾测序深度，检出极低频率的突变，但同时又不增加测序的假阳性误差。既往UMI技术主要用于微量DNA检测，如：考古、物种鉴定及公安机关侦查鉴定等[19]。AL患儿化疗后残留的白血病细胞极少，如果采用传统NGS测序技术则误差较大，因此本研究设计并建立使用UMI技术标记后的SD-NGS技术进行MRD检测。

对于ALL及MPAL的ALL细胞群，FCM快捷方便且可靠性较高，已经成为MRD检测的常规方法[8]，而对于AML和MPAL患儿的AML细胞群，FCM检测的应用尚有争议[21-22]。本研究采用的NGS-MRD技术灵敏度(10-5)稍高于FCM-MRD技术(10-4)；而对于AML和MPAL患儿的AML细胞群，NGS-MRD技术的灵敏度则明显高于FCM-MRD技术(10-3)。PCR-MRD灵敏度虽然较高，但超过50%的AL患儿无法采用PCR-MRD技术。

4 结 论

总之，随着科学技术的不断进步，NGS技术和WES测序已经在白血病诊疗中得到广泛应用。本课题组首先采用WES测序技术给每个AL患儿都能够找到合适的肿瘤基因突变位点作为MRD分子标记，再采用UMI标记的SD-NGS技术对基因突变位点进行检测，结果显示NGS-MRD技术的灵敏度和特异度都不低于FCM-MRD和PCR-MRD技术，且通过WES测序还可以发现对治疗方案和预后有指导意义的基因突变，可能是一种新的白血病MRD检测方法。但本研究的样本量较小，且对于不同亚型的AL患儿本方法对于指导临床诊疗是否具有相同效果尚需进一步研究。