右美托咪啶复合帕瑞昔布对胆总管结扎大鼠术后血管新生相关因子表达的影响*

杨明友，张 超，张 铭，鲁开智

陆军军医大学第一附属医院麻醉科(重庆 400038)

肝肺综合征(Hepatopulmonary syndrome, HPS)病死率高、防治困难，近年报道发现病理性肺血管新生在HPS的发生发展中起到重要作用[1]。同时动物实验也证实VEGF、SDF-1以及CX3CL1等血管新生相关因子在HPS大鼠外周血和肺组织中表达增高，这些因子一方面可通过直接作用于微血管内皮细胞促进其增殖，另一方面可以通过募集干细胞及单核细胞间接的促进HPS大鼠肺病理性血管新生[2-4]。右美托咪定是一种选择性α2肾上腺素能受体激动剂，具有镇静、抗焦虑、抗交感和镇痛的药理作用，可减轻手术应激反应并且可抑制促炎细胞因子的释放，具有一定的器官保护作用[5]。我们的研究也发现术中持续给予右美托咪定能够显著降低肝门阻断患者围手术期血浆SDF-1的表达水平[6]。由于环氧化酶-2(COX-2)在炎症反应中具有重要作用，并且研究发现COX-2的激活明显促进了胆总管结扎(CBDL)大鼠巨噬细胞聚集以及炎症性血管新生[4]。为此，本研究拟通过建立HPS动物模型，术后应用右美托咪啶复合COX-2抑制剂帕瑞昔布并对比单纯应用右美托咪啶的效果，检测不同时间点血浆和肺组织中VEGF、SDF-1以及CX3CL1等血管新生相关因子的表达变化以及术后3周动脉血氧合的改善情况，为进一步研究肝肺综合征患者的临床治疗方案提供基础。

材料和方法

1 实验动物 SPF级健康雄性SD大鼠，体重(200～220)g，购自第三军医大学野战外科研究所动物室，饲养在有灯光控制分12 h白昼变换的房间，自由饮水和进食标准食物。实验前至少1周在该房间适应环境。

2 实验分组及梗阻性黄疸模型的建立 将实验动物分为四组，每组24只：Sham手术组(S组)、CBDL手术组(C组)、CBDL+右美托咪啶组(D组)、CBDL+右美托咪啶复合帕瑞昔布组(DP组)，四组均以术后7、14 d 和21 d三个时相点分为三个亚组，每组样本数为8只。在实验之前，大鼠禁食12 h，仅给自由饮水。麻醉方法：腹腔注射5% 水合氯醛麻醉(0.08 ml/kg)。CBDL大鼠手术方法：沿上腹正中线切开皮肤，剪开皮下组织、腹膜进腹；沿肝十二指肠韧带寻找胆总管，于胰腺上方近十二指肠处游离胆总管，双重结扎，并于两结扎线之间切断；连续缝合腹膜、皮下组织、皮肤、关腹；待复温至动物苏醒后，移入动物房，术后动物自由饮食。具体给药方式如下(术后第1天开始)：D组每日尾静脉注射10 μg/kg右美托咪啶；DP组每日静脉注射10 μg/kg右美托咪啶+10 mg/kg帕瑞昔布；C组和S组每日静脉注射等量生理盐水。S组手术方法：仅行一个简单的剖腹手术，分离但总管但并不结扎，然后在7、14、21 d处死动物取血浆、肺，保存于-80℃待测。

3 组织匀浆 取组织块(0.2～1 g)，在冰冷的生理盐水中漂洗，除去血液，滤纸拭干，称重，放入5 ml的小烧杯内，然后用移液管量取0.86%冷生理盐水，匀浆介质或生理盐水的体积总量是组织块重量的9倍，用移液管或移液器取总量的2/3的匀浆介质或生理盐水于烧杯中，眼科小剪尽快剪碎组织块。将剪碎的组织倒入玻璃匀浆管中，再将剩余的1/3匀浆介质或生理盐水冲洗残留在烧杯中的碎组织块，一起倒入匀浆管中进行匀浆，左手持匀浆管将下端插入盛有冰水混合物的器皿中，右手将捣杆垂直插入套管中，上下转动研磨数10次(6～8 min)，充分研碎，使组织匀浆化。匀浆的组织以3000 r/min离心10 min，取上清液待测。

4 VEGF、SDF-1、CX3CL1检测 获取各组大鼠血浆以及按上述方法得到的匀浆肺组织上清液后；采用ELISA法按照试剂盒说明书检测各组不同时间点血浆以及肺组织中VEGF、SDF-1和CX3CL1的表达水平。

5 动脉血气分析 从大鼠腹主动脉抽取动脉血并使用ABL 700血气分析仪进行血气分析。

6 肺组织HE染色 取大鼠左肺下叶，用PBS将残留血液漂洗干净，经4%多聚甲醛固定48 h、制成石蜡切片并进行HE染色后，在光镜下观察肺组织的病理学变化。

7 统计学方法 采用SPSS 13.0统计学软件包进行分析，计量资料以均数±标准差表示，组间比较采用成组t检验，P<0.05为差异有统计学意义。

结 果

1 四组各时间点血浆和肺组织VEGF、SDF-1和CX3CL1表达变化 与S组相比，C组血浆和肺组织SDF-1以及CX3CL1在各个时间点的表达均明显升高，而VEGF仅在术后21 d高于S组。C组和D组相比，血浆和肺组织中各时间点VEGF和CX3CL1的表达水平均无统计学差异(P>0.05)，其中SDF-1的表达仅在术后7 d有差异。而DP组与C组相比，术后各时间点血浆及肺组织VEGF、SDF-1和CX3CL1表达均明显降低(P<0.05)。见表1～3。

表1 四组各时间点血浆和肺组织VEGF表达水平 (pg/ml)

注：与S组同时间点比较，*P<0.05；与C组同时间点比较，△P<0.05

表2 四组各时间点血浆和肺组织SDF-1表达水平 (ng/ml )

注：与S组同时间点比较，*P<0.05；与C组同时间点比较，△P<0.05

表3 四组各时间点血浆和肺组织CX3CL1表达水平 (ng/ml)

注：与S组同时间点比较，*P<0.05；与C组同时间点比较，△P<0.05

2 术后21 d各组血气分析结果变化 动脉血气分析结果显示：C组大鼠动脉血氧分压(PO2)明显低于S组大鼠而二氧化碳分压(PCO2)没有明显差异；同时，C组的动静脉血氧分压差(AaPO2)与S组相比明显升高。D组血气结果各项指标变化不大，与C组相比，差异没有统计学意义，而DP组的动脉氧分压(PO2)和动静脉氧分压差(AaPO2)指标均明显好转。见表4。

表4 术后21 d各组血气分析结果变化 (mmHg )

注：与S组比较，*P<0.05；与C组比较，△P<0.05

3 术后21 d各组大鼠肺组织HE染色 肺组织HE染色结果显示：与S组相比，C组大鼠肺组织炎性细胞浸润明显、肺泡结构紊乱、肺间质增厚；同时肺微血管扩张、数量增多。D组与C组相比病理表现没用明显改善，而DP组的炎性细胞浸润与血管增生水平均明显降低(图1)。

图1 各组肺组织HE染色结果 (200×)

讨 论

肝肺综合征是慢性肝病的严重肺部并发症，最近的研究表明，病理性血管新生和增殖性损伤在CBDL大鼠肝损伤和肺损伤中起到关键作用，在一定程度上也促进了肝肺综合征的发生发展[7]。而肺血管新生是一个多细胞参与的复杂过程，主要包括肺微血管内皮细胞(Pulmonary microvascular endothelial cells, PMVECs)的异常增殖、干细胞归巢嵌入和单核细胞聚集炎性血管新生等[8]。研究发现SDF-1/CXCR4趋化信号轴在介导c-kit+细胞参与HPS肺血管新生中起到重要的作用，该研究显示SDF-1在HPS大鼠肺组织中的表达明显增多，并通过激活下游信号促进c-kit+细胞迁移到肺微血管，同时促进其旁分泌VEGF功能增强[2]。同时，Fallon等人的研究团队发现CX3CL1可趋化单核细胞在肺内聚集，最后通过促进VEGF的表达从而促进HPS动物模型后期肺微血管的炎性增生[9]。以上研究提示VEGF、SDF-1以及CX3CL1均在HPS动物模型肺血管新生中起到重要作用，因此针对这些血管新生因子进行调控可控制HPS血管新生进程从而对HPS起到治疗作用。

在我们既往的研究中发现术中持续给予右美托咪定能够显著降低肝门阻断患者围手术期血浆SDF-1的表达水平[6]。同时，研究发现环氧化酶2抑制剂帕瑞昔布钠可以有效抑制HPS大鼠肺炎性血管新生[4]。因此在本次研究中，我们通过对比单独应用右美托咪定和右美托咪定复合帕瑞昔布钠对HPS大鼠血管新生相关因子的表达以及氧合功能的影响，进而探索针对HPS可能的治疗策略。我们的研究结果发现：CBDL组大鼠各时间点血浆和肺组织中SDF-1和CX3CL1的表达水平明显高于Sham组，而VEGF则仅在术后21 d增高明显。单独给予右美托咪啶处理仅对早期SDF-1的表达具有抑制作用，而对CX3CL1以及后期VEGF和SDF-1的表达均无明显影响；联合应用右美托咪啶和帕瑞昔布钠后，CBDL组大鼠不同时间点各细胞因子的表达均明显下降，提示右美托咪啶和帕瑞昔布钠通过各自不同的机制对HPS大鼠各阶段的血管新生因子的表达产生抑制作用。在CBDL的早期阶段，肝脏和远端器官可能被增多的胆红素、内毒素和炎症介质所损伤。而在晚期阶段肝脏急性损伤逐渐代偿、形成慢性肝硬化的改变，并最终导致肺部病变引起顽固性低氧血症[10-11]。因此我们推测，早期CBDL大鼠主要是急性损伤引起的趋化因子SDF-1和CX3CL1表达的增高，而在疾病晚期持续性的缺氧和炎症则成为各趋化因子表达增高的主要原因，并最终通过相关细胞的聚集引起VEGF的表达增高。右美托咪啶可通过激活α2肾上腺素能受体以及增强迷走神经兴奋性从而发挥抗炎及抗交感作用[12-13]，单独应用右美托咪啶仅对HPS大鼠早期SFD-1的表达增高具有抑制作用，表明右美托咪啶主要可能通过对HPS大鼠早期急性损伤抗交感作用来抑制SDF-1的表达，该结果也表明早期SDF-1与CX3CL1的表达增多机制不同。当联合应用右美托咪定和帕瑞昔布钠后，帕瑞昔布钠通过抑制环氧化酶2发挥持续性抗炎作用从而抑制疾病后期SDF-1、CX3CL1以及VEGF的表达，从而改善HPS的症状。

综上所述，右美托咪啶复合帕瑞昔布钠对实验性HPS大鼠模型血管新生相关因子SDF-1、CX3CL1以及VEGF的表达具有明显的抑制作用，能有效改善HPS大鼠氧合状态。而右美托咪啶和帕瑞昔布钠作为临床上常用的两种药物，具有重要的临床价值，该结果对进一步临床探索HPS的治疗手段具有参考意义。