超高效液相色谱-串联质谱法检测鸡肉中尼卡巴嗪残留标志物

曹爱巧，黄 婷，吴雯娟，罗 燕

（深圳市农产品质量安全检验检测中心， 广东深圳 518000）

尼卡巴嗪为4,4'-二硝基均二脲（DNC）和2-羟基-4,6二甲嘧啶（HDP）的复合物，是一种养禽业常用的性能优良、广谱、高效抗球虫药，对球虫第二代裂殖体有效，推荐剂量下，不会影响鸡对球虫产生免疫力，但应在高温季节慎用，产蛋期禁用[1]。HDP在动物体内由尿液排出，代谢迅速。而DNC通过粪便排出，代谢缓慢[2-4]，不能完全代谢而排除体外，因而在肌肉及其他组织中会出现不同程度的残留，人们食用该食物后会产生潜在危害[5-7]。 联合国粮农组织以及新西兰、日本和我国等均以DNC单体作为尼卡巴嗪的残留标识物[8]。为规范尼卡巴嗪在养殖鸡群中的用药，很多国家规定了鸡肉中的尼卡巴嗪残留标识物和最高残留限量（MRL）[9]。我国原农业部2002年发布了235号公告，规定了鸡肉中的尼卡巴嗪MRL为200 μg/kg[10]。目前尼卡巴嗪的检测方法有气相色谱法、微柱高效液相色谱法、高效液相法、差示脉冲极谱法、分光光度计法、免疫色谱法、高效液相色谱-串联质谱法（UPLCMS/MS）[5]。本研究基于UPLC-MS/MS，建立了简便、快捷、高效的鸡肉中尼卡巴嗪残留标志物DNC检测方法。

1 材料与方法

1.1 试验材料

1.1.1 样品 在市场中抽取鸡胸、鸡腿部位的新鲜鸡肉，充分绞碎并作匀质处理后，-20 ℃避光保存。

1.1.2 仪器与设备 Triple QuadTM4500质谱仪：美国AB Sciex公司；N-EVAP-24型全自动氮吹仪：美国Organomation公司；旋涡混合器：IKA Vortex 3，德国；PL602E型天平：瑞士梅特勒；3-30KS离心机：德国Sigma；Milli-Q Integral 3型超纯水仪：法国默克密理博公司；AS系列超声波清洗机：天津奥特赛斯；Watses PRIME HLB固相萃取柱（6 cc、200 mg）：上海楚定科技。

1.1.3 主要试剂与标准物质 乙腈、甲醇、甲酸，均为色谱纯；乙腈水提取液：80.0%乙腈水溶液+0.2%甲酸；复溶液：10%甲醇+90%水+0.09%甲酸；标准物质：4,4'-二硝基均二苯脲、4,4'-二硝基均二苯脲-D8，均为德国Dr.Ehrenstorfer标准品。

1.2 方法

1.2.1 标准溶液配置 准确称取4,4'-二硝基均二苯脲、4,4'-二硝基均二苯脲-D8标准品，用甲醇分别配成约1.00 mg/mL的标准储备液，-18 ℃冰箱中保存。

1.2.2 试验操作 称取样品2.50 g（精确到0.01 g）置于50 mL离心管中，加入50 μL 100 μg/kg DNC-D8标准工作液和10 mL乙腈水提取液，漩涡混匀5 min，超声提取5 min， 9 000 r/min离心5 min。取上清液3.5 mL直接过 Watses PRIME HLB固相萃取柱（6 cc、200 mg），保持1滴/s速度，收集滤液；准确移出2.5 mL滤液至15 mL带刻度离心管内，40 ℃水浴氮吹至滤液少于0.5 mL；用复溶液定容至1.0 mL，过0.22 μm滤膜后，供液相色谱-串联质谱测定。

1.3 仪器条件

1.3.1 高效液相色谱条件 使用ACQUITYUPLC BEH C18（1.7 μm，2.1 mm×100 mm）色谱柱，流动相A相为0.1%甲酸水溶液，流动相B相为甲醇溶液，柱温为40 ℃，进样量为5.0 μL。梯度洗脱条件见表 1。

表1 梯度洗脱条件

1.3.2 质谱条件 电喷雾离子源、负离子扫描、多反应监测（MRM）、-4 500 V电喷雾电压、600 ℃离子源温度、30 psi气帘气压力、8 psi碰撞气压力、60 psi雾化气压力、65 psi辅助加热气压力。DNC的质谱参数见表 2，空白基质及添加药物样本色谱图分别见图 1、图2。

表2 DNC的质谱参数

图1 DNC空白基质添加1.00 μg/kg的色谱图

图2 DNC-D8空白基质添加5.00 μg/kg的色谱图

2 结果与分析

2.1 标准曲线

经1.2.2试验方法处理获得5个样品空白提取液；用样品空白提取液配制混合外标浓度分别为2.0、10.0、20.0、200.0、500.0 μg/L的系列标准曲线，供液相色谱串联质谱测定。

DNC基质试验的线性范围在2.0～500.0 μg/L内，峰面积与相应回收浓度呈现良好的线性关系，线性回归方程为y = 0.968 9x+12.354，其相关系数为r = 0.999 26，见图3。

2.2 检出限确定

取空白鸡肉样本，添加浓度为1.0 μg/kg，按照上述方法进行全过程预处理，上机测定，平行样本 n=7，根据各样本检测值，计算出平均值及标准偏差 Sb，再根据公式检出限（MDL）=（k×Sb×C）k为置信因子，一般取3）[11]，计算出DNC检出限为0.11 μg/kg，满足检测需求。

2.3 回收率测定

用空白鸡肉样品为基质，进行1.0、10.0、200.0 μg/kg 3个水平的阳性添加回收试验，每个水平取 6个平行样，按1.2.2中的方法进行处理，供液相色谱串联质谱测定。平均回收率和相对标准偏差结果（表3）说明：1.0、10.0、200.0 μg/kg 阳性添加回收率范围分别为91.4%～101.0%、96.0%～98.5%、96.0%～103.0%，均在90%～110%之间，相对标准偏差分别为3.96%、0.92%、2.76%，均小于5%，具有较好的精密度和准确度，满足检测要求。

图3 DNC空白基质加标曲线谱图

表3 DNC的加标样品回收率及相对标准偏差

3 结论

本方法采取超高效液相色谱-串联质谱法，以DNC-D8为内标，建立了鸡肉中尼卡巴嗪残留标志物DNC的测定方法。经优化试验验证，一系列浓度的标准样本溶液（2.0、10.0、20.0、200.0、500.0 μg/L）的标准曲线相关系数为r=0.999 26，方法检出限均为0.11 μg/kg。加标回收试验的DNC 加标浓度分别为 1.0、10.0、200.0 μg/kg，回收率范围为91.4%～103.0%，相对标准偏差为0.92%～3.96%，同时进行多批次的实际样品检测，均能满足兽药残留分析的相关要求。本研究建立的方法具有简便快捷、专属性强、灵敏度高等特点，相关参数优化较佳，可准确对样品进行定性和定量检测，适用于可食动物肌肉中尼卡巴嗪残留标志物DNC的检测。