石斑鱼育苗场传染性病原（病毒）传入途径风险评估指标体系的构建

马红玲，徐力文，程长洪，苏友禄，邓益琴，冯 娟，郭志勋

（中国水产科学研究院南海水产研究所，农业农村部南海渔业资源开发利用重点实验室，广东广州 510300）

随着世界人口增长导致的需求增加和过度捕捞导致的资源匮乏，全球水产养殖总产量不断增加。而伴随着水产养殖规模的扩大和国际贸易的增加，水生动物疾病已成为制约全球水产养殖生产和贸易可持续发展的主要因素之一。

实施生物安保措施是预防疾病最有效的方法之一[1]。在20世纪90年代就有学者在动物疫病预防与控制中采用了生物安保理念。如欧盟、加拿大等通过发展和完善相应的生物安全措施，有效控制了疾病暴发[2-3]。然而，生物安保对水产养殖来说是一个相对较新的领域。1997年世界水产养殖协会（WAS）召开特别会议，介绍和讨论了水产养殖中的生物安全。随后，美国、泰国和印度尼西亚在对虾种苗培养中实施了生物安保措施，成功建立了无特定病原对虾种苗繁育基地[4]。美国、加拿大、智利以及欧洲部分国家将生物安保原理应用于鱼类养殖场重要疫病防控，探索相关方法[5-7]。过去十几年，FAO、亚太经济合作组织（APEC）、亚太水产养殖中心网（NACA）和墨西哥环境、资源和渔业部（SEMARNAP）等组织或机构的相关学者对生物安保计划的内涵和方法作了大量讨论和辩论[8]。众多行业、专业、政府和国际组织投入了大量时间和精力，将某些生物安全措施纳入最佳管理实践，一些也被纳入了相关法规[9-10]

生物安保计划重点在于预防疾病以及确认和维持流行病单元无疫状态，这对水产养殖和畜牧业发展以及商品贸易有重要影响[11]。自愿或法规规定实施有效生物安保计划的国家不仅增加了产品产量，而且增加了产品经济价值[1]。鉴于全球水产养殖业病害发生风险日益增加，危害日益严重，人们迫切需要制定一套规范标准的生物安保实施方案来来预防控制和可能根除水产养殖业中传染性病原。2009和2011年在挪威召开的两次国际水产养殖生物安保大会上，与会专家组建了一个非官方的国际水产兽医生物安保联盟，并于2015年开发了首套生物安保计划整体实施方案，为养殖者和政府监管机构提供了生物安保战略解决方案[11]。

我国是世界渔业大国。伴随着水产养殖业的快速发展，水产养殖新品种的不断增加，养殖模式的不断创新和国际贸易的持续增加，水产养殖病害问题日益严重，严重影响了我国水产养殖业的发展。然而我国目前从政府、科研部门、相关行业部门到养殖户普遍对生物安保的理念匮乏，养殖户虽然对病原了解很好，但对传播途径理解有限，导致采取的生物安保措施薄弱[12-13]。了解病原传播路线，鉴定病原传入途径，对后续确定病原传入关键控制点，制定合适的风险消减措施至关重要[14-15]。为此，该研究在调查、分析石斑鱼育苗场主要传染性病病原传入途径的基础上，设计调查问卷，运用德尔菲法，对相关专家进行两轮咨询，请专家对相关风险因子的重要性进行评价，初步构建了石斑鱼育苗场传染性病原传入途径风险评估指标体系，为养殖户和监管机构客观评价石斑鱼育苗场疫病传入风险级别提供评价依据，为育苗场实施石斑鱼疫病风险管理，降低疫病发生风险，开展生物安保计划提供依据和对策。

1 材料与方法

1.1 研究方法

本研究运用德尔菲（Delphi）调查法，构建石斑鱼育苗场传染性病原传入途径风险评估指标体系。具体步骤包括：第一，风险因素确定。通过资料查阅和实际调查数据，采用幕景分析法，分析石斑鱼整个育苗流程，并咨询研究人员、鱼病兽医师和养殖户，总结整理石斑鱼育苗场传染性病原传入的所有可能途径。第二，问卷调查。向专家组提出所要预测的问题、要求和背景资料，采用开放式调查问卷，请专家对相关风险因子的重要性进行评价。第三，再次问卷调查。将上一轮调查结果汇总统计，根据意见，删除、修订指标，制定新一轮调查问卷，并将新一轮问卷和汇总统计的专家意见作为参考资料，再寄发给每位专家，供专家们分析判断。第四，构建指标体系。将两轮专家意见意，运用统计学方法筛选和修订评估指标，最终构建出科学的石斑鱼育苗场传染性病原传入途径风险评估指标体系。

1.2 研究步骤

1.2.1 风险因素确定 首先通过资料查询和实际调查数据分析，列出石斑鱼主要疫病病原目录：病毒性神经坏死病毒（viral nervous necrosis virus，NNV），石斑鱼肿大细胞虹彩病毒（grouper iridovirus，genus megalocytivirus，GIV-M） 和石斑鱼蛙虹彩病毒（grouper iridovirus，genus ranavirus，GIV-R）[16]。其中，NNV主要危害体长3.5 cm内的石斑鱼幼苗，GIV-M和GIV-R则主要危害5～12 cm石斑鱼幼鱼。然后，通过文献搜查，总结疫病的病原特性、流行病学数据、传播途径和宿主范围等相关背景资料，最后通过现场考察、资料查询和专家咨询石斑鱼育苗流程，采样幕景分析法，初步对石斑鱼育苗流程中的这3种病原引入的风险因素进行识别。

1.2.2 咨询专家选择 向第二届农业农村部水产养殖病害防治专家委员会中的部分专家发出研究邀请邮件，并请受邀专家推荐他认为相关领域的其他专家参与本项研究。最终在华南地区遴选了18名从事水生动物病害防控及相关领域工作并且经验丰富的专家，包括高校和研究所从事病原及流行病学研究、病害防控等相关领域的研究人员，以及从事水生动物疫病预防控制的管理人员和具有丰富育苗经验的企业养殖户。

1.2.3 两轮专家咨询 调查共分为两轮。第一轮调查为开放性调查，请专家对初步分析的相关风险因子的重要性进行评价并给出修改意见；在收集第一轮所有专家意见后，对结果进行统计、汇总，并根据专家意见，采用临界值法，对风险因子进行增删，并将此作为反馈材料返给专家，请各位专家参考第一轮问卷调查结果再次进行判断。要求所有专家在21 d 内完成调查问卷，只有完成上一轮调查问卷的专家才会继续下一轮问卷调查。第一轮调查包含四个部分：第一部分是向专家介绍课题的研究内容、方法和目的，并附上课题的背景资料，供专家参考；第二部分是调查因素重要性评价表，在此表中列出初步分析的所有风险因子的一级指标和二级指标，请专家进行认可度评价；第三部分是专家个人信息，请专家填写相关个人信息和对相关知识的熟悉程度，以及对本次咨询作出判断的依据。第一轮调查后，结合专家意见和统计学结果，调整第一轮调查问卷，从而形成第二轮调查问卷，包括两个部分：第一部分向专家提供第一次调查所有专家的数据统计分析结果及专家意见；第二部分是修改后的调查问卷，请专家参考第一轮问卷调查结果再次进行判断，专家可以坚持或修改自己的意见。

1.3 数据处理与分析

使用Excel 2010和SPSS 11.5软件完成统计学分析。专家可靠性和咨询结果的可信度，通过专家积极系数、专家权威程度、集中程度和专家意见协调程度等指标来表示。其中，专家积极系数即专家的应答率，用问卷的回收率来表示；专家的权威程度，用专家的权威系数表示；集中程度，用指标的满分频率和重要性赋值均数；专家意见协调程度，用肯德尔（kendell）协调系数表示。评价指标的筛选，采用界值法，根据专家对各项指标的重要性打分结果，计算满分频率、均数、标准差和变异系数，筛选一级指标和二级指标。

2 结果

2.1 专家基本情况

本研究邀请了18名从事水生动物流行病学、病原学、病害防控、病害检测及石斑鱼养殖方面的专家。年龄范围为43～58岁，平均年龄为（48±5）岁，平均工作年限为（25±5）年。专家具体情况见表1。

2.2 专家积极系数和权威程度

专家积极系数通过专家咨询表的回收率来衡量。该研究进行了两轮专家咨询，问卷回收率分别为90%（18/20）和100%（18/18），提出建设性修订意见的专家比例分别为60%（12/18）和27%（5/18），专家主要对二级指标的相关内容提出了建议。结果表明，专家对本研究持非常积极的态度。

表1 专家信息汇总

专家权威程度由专家权威系数Cr反映。权威系数为专家对指标进行判断的依据（用判断依据系数Ca表示）和专家对指标的熟悉程度（用熟悉程度系数Cs）的算术平均数。专家熟悉程度系数可用Likert标度法分级，从高到底分为非常熟悉、比较熟悉、一般、了解一点、不熟悉5个等级，分别赋值1、0.8、0.6、0.4、0.2。判断依据包括实践经验、理论分析、国内外同行了解和直觉，根据专家对判断依据的影响程度分为“大”“中”“小”3个等级，其中“实践经验”判断依据系数分别赋值为0.5、0.4、0.3，“理论分析”判断依据系数分别赋值为0.3、0.2、0.1，“国内外同行了解”判断依据系数分别赋值为0.1、0.1、0.05，“直觉”判断依据系数分别赋值为0.1、0.1、0.05[17]。本研究咨询专家对咨询内容熟悉程度的自评结果及对判断依据的依赖程度自评结果见表2和表3。

表2 专家对咨询内容熟悉程度的自评结果

表3 专家对风险因子的判断依据自评结果

结果显示，专家对水产动物病害流行病学的熟悉程度平均系数为0.877 8，对水产动物健康养殖的熟悉程度平均系数为0.888 9，平均熟悉程度系数为Cs=0.883 3。专家对理论分析依赖程度平均系数为0.233 3，对实践经验依赖程度平均系数为0.483 3，对国内外同行了解依赖程度平均系数为0.1，对直觉的依赖程度平均系数为0.069 4，计算的判断依据系数Ca=0.886 1，根据公式 Cr=（Ca+Cs）/2，计算得出Cr=0.884 7。一般认为，专家权威程度≥0.70，则咨询结果可靠。结果显示，专家对本研究的权威程度较高，咨询具有较高的可靠性。

2.3 专家意见协调程度

专家整体意见协调程度是通过计算协调系数（肯德尔和谐系数，W ）和卡方（χ2）检验进行评价。肯德尔和谐系数能有效检查所有专家所得评价结果的一致性，反映所有专家对所有指标赋值的协调程度。协调系数介于0～1之间，越接近1，则说明专家对咨询问题意见分歧越小，意见越一致，则结果越可靠[18]。本研究两轮调查的W、χ2和P值如表4所示。通过计算两轮专家咨询，发现肯德尔和谐系数增加，专的意见趋向一致。其中：NNV的一级指标和谐系数值由0.419增加到0.568，GIV-M的一级指标和谐系数值由0.400增加到0.434，GIV-R的一级指标和谐系数值由0.397增加到0.461，P值均＜0.05；NNV的二级指标和谐系数值由0.440增加到0.595，GIV-M的二级指标和谐系数值由0.423增加到0.550，GIV-R的二级指标和谐系数值由0.429增加到0.542，P值均＜0.05。

表4 两轮专家意见协调系数比较

2.4 评估指标筛选

本研究共进行两轮德尔菲调查，采用界值法筛选石斑鱼育苗场传染性病原传入风险评估指标，临界值通过计算每项指标重要性得分的满分频率、算术均数和变异系数来确定。其中，满分频率和算术均数的临界值计算方法，采用“临界值=算数均数-标准差”，得分高于临界值的指标入选；变异系数临界值计算方法，采用“临界值=算数均数+标准差”，得分低于临界值的指标入选。两轮德尔菲专家咨询结果的满分频率、算术均数、变异系数和指标筛选临界值见表5。为防止重要指标被剔除，当指标的满分频率、算数均数和变异系数3项均不符合筛选条件才删除相应指标，对于有1个或2个条件不符合要求的指标，结合专家建议，经研究小组讨论后确定是否删除。另外，根据专家反馈的建议，修订了部分二级指标内容（表6和表7）。第一轮31项二级指标，根据专家意见，合并和删除了7项，修订了2项；第二轮24项二级指标，根据专家意见，删除了3项，保留21项。

2.5 评估指标体系

通过两轮德尔菲专家咨询，最终形成4项一级指标、21项二级指标的石斑鱼育苗场传染性病原传入途径风险评估指标体系初步框架（表8）。

3 讨论

1995 年世界贸易组织（WTO）制定的《实施卫生与植物卫生措施协议》（SPS 协议）是生物安保的主要管理文书，强调要应用风险分析作为采取任何SPS措施的基础。风险分析作为重要的决策工具已广泛应用于动物卫生管理领域[19]。一些畜牧业国家如澳大利亚，法国等已将风险分析方法用于口蹄疫、禽流感、猪瘟等多种陆生动物疾病防控[20-21]。在水生动物方面，风险分析已用于病毒性出血性败血症、锦鲤疱疹病毒病、传染性造血器官坏死病等重要疫病的水产品进出口贸易中及疫病监测领域[22]。我国在水生动物卫生管理风险分析方面主要应用于水产品进口[23-26]及水生动物疫病发生风险[27-28]等方面。

表5 两轮专家调查筛选指标临界值

表6 第一轮调查数据

表7 第二轮调查数据

简单来说，生物安保计划是鉴定病原传入和传播的主要潜在途径，并采取措施消减病原引入和传播风险[11]，具体措施会随着应用生物安全战略的水平（养殖场、地区、国家和国际）不同而变化。其流程复杂，包括危害和风险分析，关键控制点分析和补救，疾病检测和监测，应急计划以及兽医审核和证明确认无疫。其中，危害和风险分析是第一步，风险分析可以作为决策手段用以改进水生生物安保措施。对任何风险评估来说，鉴定病原引入途径、制定合适的生物安全措施对于风险消减至关重要[14]。在国外（欧洲、瑞士、德国）开展了较多传染性病原传入鱼类养殖场的风险因素研究[29-31]，国内的报道主要是关于畜牧类养殖场疫病传入风险研究[32-33]，而还少见养殖场水平鱼类病原传入风险评估相关研究。

表8 石斑鱼育苗场传染性病原传入途径风险评估指标体系

风险评估指标体系是风险评估的关键和重点，选择适宜的评价指标可以使风险分析的结果更加直观、实用、有效[34]。在信息量大、数据缺乏的情况下，利用专家的知识和经验进行风险评估是国内外常用的一种方法[31，35]。国内16篇涉及个病的动物疫病风险评估模型中，使用德尔菲法构建的将近4成[36]。通过资料查询、实际调查数据分析和幕景分析法，分析石斑鱼育苗流程，初步得到石斑鱼育苗流程中的3种重要病毒性传染病原引入的风险因素，请专家对各风险因素进行重要性评估，初步构建了石斑鱼育苗场传染性病原传入途径风险评估指标体系。该研究构建的评估指标体系的一级指标包含活鱼及卵活动、饵料投喂、水暴露、机械传播共4种风险主题，其中活鱼及卵活动是最重要的病原传入途径。本研究和国外多名学者的研究结果相似。Klenigeld等[29]认为，活鱼和卵活动、生物安全措施、水暴露、与其他养鱼场的距离以及养殖场管理是病原传入的5个风险途径；Diserens等[30]认为，养殖品种（敏感、传播载体和不敏感）、供水类型、活鱼活动、附近养鱼场、鱼类加工厂和生物安全措施是病毒性出血败血症病毒（viral haemorrhagic septicemia virus，VHSV）或传染性造血器官坏死病病毒（infectious hematopoietic necrosis virus，IHNV）传入瑞士鱼类养殖场的6个风险因素；Oidtmann等[37]通过专家咨询鉴定了淡水鲑鱼养殖场病原传入的5个风险途径，包括活鱼和卵活动、水暴露、养殖场上原位建立加工厂、地理因素和机械传播，并且认为活鱼和卵活动是风险最大的传入途径；Oidtmann等[31]在随后的研究中又鉴定了IHNV、VHSV、锦鲤疱疹病毒（koi herpesvirus，KHV）和传染性鲑鱼贫血症病毒（infectious salmon anaemia virus，ISAV）这4种病原传入欧盟鱼类养殖场的5个风险主题，包括活鱼和卵活动、水暴露、养殖场上原位建立加工厂、近距离机械传播和与距离无关的机械传播。目前，水产苗种带病流通是我国水产养殖疫病防控面临的难题。国家非常重视水产苗种产地检疫工作，然而由于体系还不健全、普法宣传不足等多方原因，水产苗种产地检疫还处于初步发展阶段，全面实施产地检疫依然任重道远。

养殖场水生动物病原传入和传播的主要途径在很大程度上是相同[38]，包括活物运输、通过污染的水传播、污染物、活的传媒或水生动物产品，但还需根据病原特征、养殖特点以及环境等因素不同而具体分析。国外的鲑鱼等养殖鱼类从苗期一直使用的是人工配合饲料，因此饵料投喂不是病原传入的风险途径。但我国在石斑鱼育苗过程中，技术标准并不统一。在挠足类投喂阶段，有些育苗场会直接过渡到人工配合饲料，但有些育苗场会使用饵料鱼糜和虾糜进行驯化，逐渐过渡到人工配合饲料。饵料鱼有可能是病原的携带者，比如NNV、GIV-M和GIV-R，因此也被认为是病原传入的潜在途径之一。研究显示，NNV、GIV-M和GIV-R这3种病毒性病原传入石斑鱼育苗场的风险评估指标体系是一致的，但由于病原特性不同，不同的指标权重将有所不同，例如GIV-R的宿主范围较窄，因此饵料喂养的权重也低（数据暂未发表）。

专家的选择是德尔菲法的一个关键环节，专家选择是否合适是评估成功的关键[39]。为确保专家的权威性，在第二届农业农村部水产养殖病害防治专家委员会专家及其推荐的专家中，遴选了18名专家，主要来自高校、研究所、水生动物疫病防控主管机构和水产养殖业，长期从事病原及流行病学研究、病害防控和石斑鱼养殖等方面研究；77.78%取得硕士及以上学历，专家权威系数为0.884 7。专家组成全面、专业丰富，学历及权威系数较高，因而保证了专家的可靠性。专家意见协调系数反映了不同专家意见的一致性。该研究采用肯德尔和谐系数及卡方检验，评价专家意见协调程度，第二轮咨询的专家意见协调系数高于第一轮，表明专家意见逐渐趋向一致，无需进行第三轮专家咨询。专家协调系数的χ2检验P值均小于0.05，表明在95%的置信度下，专家评估意见协调性好，该研究专家意见可信。

该研究运用德尔菲法构建了包含活鱼及卵活动、饵料投喂、水暴露、机械传播4种风险主题，共21个风险指标的石斑鱼育苗场传染性病原传入途径风险评估指标体系。研究综合了多领域专家的观点，但可能与部分专家观点存在分歧，可以在后续实践应用中不断完善。下一步将以此为基础，构建石斑鱼育苗场传染性病原传入风险评估模型，目的是提供一个简单易行的，供石斑鱼育苗企业自我检查和评价的工具，以便于企业衡量石斑鱼主要传染性病害的防控水平，寻找减缓病原传入的关键控制点，保障养殖场水平生物安保计划的顺利实施。