特丁基对苯二酚印迹电化学传感器的构建及性能研究

邢存怀,张改霞,冯明,,赵晓丽,,方莉,*,程芳琴

(1.山西大学 化学化工学院,山西 太原 030006;2.山西低附加值煤基资源高值利用协同创新中心,山西大学 资源与环境工程研究所,山西 太原 030006)

0 引言

特丁基对苯二酚(Tertiary Butylhydroquinone,TBHQ)是一种常见的食品抗氧化剂,具有抗氧化能力强、稳定性好、成本低廉等优点,常用于食品、药品和化妆品中[1-2]。但是,过量的TBHQ抗氧化剂不仅会导致食品中营养成分的流失,还会诱发细胞死亡,其代谢物甚至会导致细胞病变,对人体产生极大的危害[3]。中国食品添加剂标准明确规定:TBHQ的最大使用量为0.2 g/kg(以油脂中的含量计)。近年来,用于检测TBHQ的方法主要有色谱法[4-7]、色质联用法[8-10]、毛细管电泳分离与端柱电流检测法[11-12]、电化学法[13-15]等。其中,电化学法具有灵敏度高、检出限低、反应速度快、操作简便等优点[16-20],但在实际样品检测中,电化学信号容易受到其他物质的干扰,从而影响检测的精确度[21]。

分子印迹技术(Molecular imprinted technique,MIT)是“精心裁制”具有特异选择性材料的一种重要方法。通过该技术合成的分子印迹聚合物(Molecularly imprinted polymers,MIPs),由于含有大量尺寸与形状一定、功能基团排列顺序也一定且与模板分子高度匹配的印迹空穴,因此对模板分子的结构具有记忆功能,可以特异性地识别与结合模板分子[22]。MIPs具有稳定性好、寿命长、构效预定性等优点,在物质的识别、分离、富集与分析监测等方面具有广阔的应用前景[23]。特别是将分子印迹技术与电化学传感器相结合制备的分子印迹电化学传感器(Molecular imprinting electrochemical sensor,MIES),既有分子印迹技术特异识别性高、重复性好的特点,又有电化学方法灵敏、高效和价格低廉的特点,近年来逐渐引起了研究者们的关注[1-2]。

MIES的核心组成是分子印迹敏感膜,其制备方法主要包括表面涂覆法、自组装法、原位引发聚合法和电化学聚合法[14],其中电聚合法装置简单,条件易于控制,膜厚均匀,所制备的MIES具有响应时间短、灵敏度高、选择性好的特点[14,24]。Cui[14]等人以吡咯为单体,采用电聚合法制备了叔丁基羟基茴香醚(BHA)的MIES用于BHA的检测,其范围在9×10-8～7×10-5mol·L-1,检出限为7.63×10-8mol·L-1,具有良好的特异选择性、优异的稳定性和良好的再现性。Tang 等人[15]通过电聚合在玻碳电极(GCE)表面上制备结晶紫(CV)的聚合膜,用于测定TBHQ时的线性范围为5×10-7～1×10-4mol·L-1,检测限为3×10-8mol·L-1(S/N=3),在维生素E、邻苯二甲酸酯和柠檬酸中具有良好的特异性。由于多壁碳纳米管(MWCNT)可以促进电子转移,增强电化学测量的灵敏度[25-26],Dai[27]等人采用电聚合法在MWCNT改性GCE表面上分步修饰聚硫堇和邻苯二胺,构建了没食子酸丙酯(PG)的MIES,以聚硫堇氧化还原介质研究了MIES对PG的电化学响应。发现其线性范围为5.0×10-8～1.0×10-4mol·L-1,检测限为2.4×10-8mol·L-1,在没食子酸(GA)、TBHQ等干扰物存在下,对PG显示出良好的特异识别性,以及优异的重复性和稳定性。Zhao等[28]通过电聚合在玻碳电极上构建了聚酰胺磺酸和MWCNT复合改性电极,同时测定氢醌(HQ)和邻苯二酚(CC)化合物。HQ(或CC)的线性浓度范围为6.0×10-6～1.0×10-4mol·L-1(或6.0×10-6～1.8×10-4mol·L-1),相应的检测限为1.0×10-6mol·L-1。

本文以吡咯为功能单体、TBHQ为目标分子,通过一步电聚合法在MWCNT修饰的GCE电极上制备了含TBHQ分子的聚吡咯印迹膜。采用循环伏安法(Cyclic Voltammetry,CV)、电化学阻抗法(electrochemical impedance spectroscopy,EIS)和差分脉冲伏安法(differential pulse voltammetry,DPV)等手段,对所构建的TBHQ分子印迹电化学传感器的导电性以及对TBHQ分子的线性响应、特异性、稳定性以及重复性等进行测试与表征。将制备的MIES用于实际样品中TBHQ含量检测,获得了满意的结果。

1 材料与方法

1.1 化学药品及试剂

MWCNTs(质量分数≥95%,深圳市纳米科技有限公司),高氯酸钠(质量分数≥10%,山东佰仟化工有限公司);N,N二甲基甲酰胺(质量分数≥99%)、CH3CH2OH(质量分数≥99%)、H2SO4(质量分数≥95%)、HNO3(质量分数≥90%)、特丁基对苯二酚(TBHQ,质量分数≥97%)、没食子酸丙酯(PG,质量分数≥98%)、没食子酸(GA,质量分数≥98.5%)、丁基化羟基苯甲醚(BHA,质量分数≥98%)、没食子酸乙酯(EG,质量分数≥98%)、对羟基苯甲酸乙酯(EPHB,质量分数≥99%)、对羟基苯甲酸丙酯(PPHB,质量分数≥99%)、吡咯(质量分数≥99%)等试剂均从Sigma Aldrich®购买。所有溶液用去离子水制备。

1.2 MWCNT/GCE的复合电极的制备

首先,将1 g MWCNT和40 mL浓硫酸和浓硝酸(3∶1)加入100 mL三口烧瓶中,升温至80℃,恒温下磁力搅拌反应4 h后冷却、过滤,用去离子水反复洗涤、离心分离,在60℃下干燥3～4 h后得到羧基化的碳纳米管(MWCNT-COOH)[29-30]。然后,将5 mg MWCNT-COOH加入1 mL N,N-二甲基甲酰胺中,超声分散1 h,得到5 mg/mL的均匀分散液备用。将GCE电极打磨至镜面,先后在水、乙醇和水中分别超声处理5 min,取5 μL MWCNT分散液滴涂于GCE电极表面,在红外灯下烘干溶剂,制得复合电极MWCNT/GCE。

1.3 TBHQ分子印迹电化学传感器(MIES)的构建

TBHQ分子印迹电化学传感器(MIES)的构建方法示意图如图1所示。

Fig.1 A schematic construction of MIES for TBHQ detection图1 TBHQ分子印迹电化学传感器的构建示意图

以甘汞电极为参比电极、Pt电极为对电极、MWCNT/GCE为工作电极,以含吡咯(0.1 mol·L-1)和TBHQ的高氯酸钠溶液(0.1 mol·L-1)为电解液,采用三电极系统,在电化学工作站(CHI660,上海辰华仪器有限公司)上采用CV法进行电聚合,制备印迹膜[31-32]。TBHQ的浓度分别设定为0.04、0.06、0.08、0.1、0.12、0.14和0.16 mmol·L-1,扫描速率为100 mV/s,扫描电压范围为-0.2～0.85 V,得到含有TBHQ分子的印迹膜,标记为TBHQ-MIP/MWCNT/GCE。

由于目标分子的洗脱效果直接影响MIP中印迹空穴的产生和对目标分子重新结合的效果。本文中的模板分子TBHQ采用电化学过氧化处理和溶剂洗脱相结合的方法去除,即以TBHQ-MIP/MWCNT/GCE为工作电极,设定电压为-0.2～1.2 V,在PBS缓冲液中采用CV扫描5圈,将过氧化处理后的电极在纯净的乙醇溶液中静置10 min,以洗脱模板分子。洗脱效果通过紫外吸收光谱(TU-1900型双光束UV-vis分光光度计,北京普析通用仪器有限责任公司)进行检测,如图2所示。其中,a为TBHQ-MIP/MWCNT/GCE印迹薄膜修饰电极经电化学过氧化洗脱后,在纯乙醇溶液中浸渍10 min后,所得乙醇溶液的UV曲线;b为第二次浸渍10 min后得乙醇溶液的UV曲线。从a曲线上可看到,289 nm处有明显的TBHQ特征峰[33-34],说明TBHQ被成功洗脱到乙醇溶液中。而b曲线相应波长处的吸收峰消失,证实所有的模板分子通过一次浸渍就完全被洗脱。最后,将模板分子TBHQ完全洗脱后,烘干溶剂乙醇,制得TBHQ分子印迹电化学传感器,标记为MIP/MWCNT/GCE。为了对比,不含模板分子的电极也以同样的方法制备,只是不加入模板分子TBHQ,标记为NIP/MWCNT/GCE。

1.4 电化学表征与测试

First elution (a) and the second elution (b)Fig.2 UV spectra of ethanol eluants of TBHQ-MIP/MWCNT/GCE(a)一次洗脱,(b)二次洗脱图2 TBHQ-MIP/MWCNT印迹膜乙醇洗脱液的UV图谱

在电化学工作站(CHI660,Chenhua Company,Shanghai,China)上进行电化学测试,以三电极为测试系统(玻碳电极为工作电极,甘汞电极为参比电极,Pt电极为对电极),所有电化学测试前,洗净所用的电解池(用浓硫酸和高锰酸钾的混合液浸泡),GCE电极打磨至镜面,电解液通N2除氧15 min。

循环伏安测试采用的电解液是含5 mmol·L-1K3[Fe(CN)6]的0.1 mol/L-1KCl溶液,扫描范围为:-0.1～0.7 V,扫描速率为50 mV/s。

电化学阻抗测试是在含5 mmol·L-1K3[Fe(CN)6]和5 mmol·L-1K4[Fe(CN)6]的0.1 mol·L-1KCl溶液中进行的。由于DPV测试的背景电流小,具有比CV更高的灵敏度,本论文采用DPV测试来表征MIES的线性范围和检出限。为了得到最佳的线性检测范围,测试前对DPV的参数进行了简单的优化,结果列于表1。在选定的优化参数条件下,向pH值为7的PBS空白电解液中依次加入不同浓度的TBHQ溶液,以MIP/MWCNT/GCE为工作电极,测试其DPV响应。

表1 DPV参数的优化

为研究MIP/MWCNT/GCE的特异选择性,PG、BHT、对羟基苯甲酸乙酯(EPHB)和对羟基苯甲酸丙酯(PPHB)几种结构性能类似的物质被选为干扰物,然后分别测试MIES对相同浓度目标分子和结构类似物质DPV响应进行表征。

重复性能是通过研究多次重复使用目标分子DPV响应峰电流的变化及相对标准偏差的大小。稳定性能测试是研究将传感器放置14 d后其对相同浓度的目标分子响应电流的变化。

1.5 实际样品检测

为了评价构建MIES 的实际应用性,我们测试了实际样品中目标分子的含量。通过加标回收法研究了食品中抗氧化剂的含量。一定量的目标物质(TBHQ、4-HR和PG)加入到样品中(其浓度为0.5和1.0 μmol·L-1),采用DPV测试目标分子的峰电流。

2 结果与讨论

2.1 模板分子TBHQ浓度对MIP/MWCNT/GCE性能的影响

图3为不同TBHQ浓度下构建的MIP/MWCNT/GCE传感器在含TBHQ的PBS溶液中(5×10-6mol·L-1) 的DPV峰电流图(设定扫描圈数为15圈)。从图中可以看到,随着模板分子TBHQ浓度增加,所构建的传感器MIP/MWCNT/GCE对TBHQ响应的峰电流逐渐增强,当TBHQ浓度为0.1 mmol·L-1时达到最大值,然后逐渐减小,当TBHQ浓度为0.16 mmol·L-1时达到最小值。这是由于当TBHQ浓度太低时,可交联到聚吡咯表面的目标分子数目偏少,因此洗脱后印迹膜上形成的空穴数目少,能够被印迹到空穴中的TBHQ分子数目也少,这就导致DPV峰电流偏低;而当目标分子浓度过大时,在聚吡咯印迹膜表面形成的空穴过多,导致印迹膜稳定性降低,不利于目标分子在空穴中的重新结合[35]。据此,选择最适合的TBHQ浓度为0.1 mmol·L-1。

Fig.3 DPV peak currents of the MIP/MWCNT/GCE sensors constructed with different TBHQ concentration in a PBS solution containing TBHQ (5×10-6mol·L-1).图3 不同TBHQ浓度下构建的MIP/MWCNT/GCE传感器在含TBHQ的PBS溶液中(5×10-6mol·L-1) 的DPV峰电流图

2.2 聚吡咯印迹膜厚度及电聚合速度对MIP/MWCNT/GCE性能的影响

图4A、4B分别为不同聚吡咯印迹膜厚度(以不同CV扫描圈数衡量)以及不同电聚合速度时(TBHQ浓度为0.1 mmol·L-1),所构建的MIP/MWCNT/GCE传感器在含TBHQ的PBS溶液中(5×10-6mol·L-1) 的DPV峰电流图。

Fig.4 DPV peak currents of the MIP/MWCNT/GCE sensors constructed with(A) different MIP thickness (based on different cycles of scan) and (B) different scan rate in a PBS solution containing TBHQ (5×10-6mol·L-1).图4 (A)不同聚吡咯印迹膜厚度(以不同CV扫描圈数衡量)、 (B)不同扫描速率下构建的MIP/MWCNT/GCE传感器在含TBHQ的PBS溶液中(5×10-6mol·L-1) 的DPV峰电流图

由于所形成的聚吡咯印迹膜的厚度与CV扫描圈数直接相关,因此以CV扫描圈数代替聚吡咯膜的厚度。从图4(A)可知,所构建的传感器在含TBHQ的PBS溶液中的DPV峰电流随着扫描圈数的增加呈现先增后减的变化趋势,当扫描15圈时,所得MIP/MWCNT/GCE传感器对 TBHQ响应的峰电流值最大。事实上,印迹膜的厚度对传感器的性能影响很大。当扫描圈数少,所形成的印迹膜太薄、强度太低,导致印迹膜易破裂而从电极表面脱落;扫描圈数过多,形成的聚合物印迹膜太厚,导致模板分子难以洗脱[35]。在最佳扫描圈数为15圈时,所形成的聚吡咯印迹膜效果最好。

从图4(B)中不同CV扫描速率条件下构建的MIP/MWCNT/GCE传感器,在含TBHQ的PBS溶液中的DPV峰电流也是先增强后减小,在扫速为100 mV/s时,DPV峰电流达到最大,说明扫描速率对传感器印迹膜的影响显著。当电聚合速率较慢时,形成的印迹膜过于致密,模板分子难以洗脱,不易形成印迹空穴;而扫描速率过快时,一方面形成的聚合物膜结构松散、稳定性差,另一方面,在吡咯快速聚合的过程中,由于模板分子与吡咯间的氢键作用力弱,使得模板分子不能及时键合于聚吡咯膜中,难以形成足够的印迹空穴[36]。在此,最佳扫描速率为100 mV/s。

2.3 不同酸度下MIP/MWCNT/GCE对目标分子TBHQ的响应

传感器对目标分子的电化学响应与电解质溶液的pH值有极大的关系。图5为所制备的传感器MIP/MWCNT/GCE在含有TBHQ的PBS缓冲液中的DPV峰电流随溶液pH值的变化曲线。显然,DPV峰电流在缓冲液的pH值为7时达到最大值,说明溶液为中性时对TBHQ的电化学响应最强;当pH小于7,随着酸度增大,DPV峰电流急剧减小,这可能是因为导电印迹膜在强酸性条件下可能会被破坏,导致电流响应下降;当pH大于7,DPV峰电流随着碱性增强同样变弱,可解释为碱性条件对TBHQ反应的促进作用,导致TBHQ分子难以键合于印迹空穴中,从而降低了电流响应值[37]。在此,控制PBS缓冲溶液的pH值为7。

Fig.5 Current response of the sensor to TBHQ in PBS solution with different pH.图5 PBS缓冲液pH值对TBHQ检测的影响

2.4 MIP/MWCNT/GCE的电化学表征

MIP/MWCNT/GCE传感器的导电性能可进一步通过MIP/MWCNT/GCE传感器电极及其他电极在含K3[Fe(CN)6](5 mmol·L-1)KCl溶液中的循环伏安曲线,在含5 mmol·L-1K3[Fe(CN)6]和K4[Fe(CN)6]的0.1 mol·L-1KCl溶液中进行Nyquist交流阻抗谱表征,结果如图6A、6B所示。

GCE (a),MWCNT/GCE (b),TBHQ-MIP/MWCNT/GCE (c),MIP/MWCNT/GCE (d),NIP/MWCNT/GCE (e)Fig.6 CVs(A)and EIS of the electrodes(B) in 5 mmol·L-1K3[Fe(CN)6]GCE (a),MWCNT/GCE (b),TBHQ-MIP/MWCNT/GCE (c),MIP/MWCNT/GCE (d),NIP/MWCNT/GCE (e)图6 电极在5 mmol·L-1K3[Fe(CN)6]溶液中的CV(A)和电化学阻抗(B)表征

对比图6(A)中的a、b两条曲线可看出,MWCNT修饰后的电极在K3[Fe(CN)6]溶液中的氧化还原峰(图6(A),b)比GCE裸电极(图6(A),a)增强了3倍多,且峰电位差变小,说明GCE表面修饰MWCNT有利于电子的传导,提高了电极的导电性。吡咯电聚合得到的TBHQ-MIP/MWCNT/GCE印迹膜的K3[Fe(CN)6]氧化还原峰急剧减弱(图6A,c),可归因于覆盖于电极表面的吡咯膜和模板分子对离子和电子传输的阻碍作用,导致K3[Fe(CN)6]难以达到电极表面发生氧化还原反应,没有加载模板分子的电极NIP/MWCNT/GCE具有相似的结果(图6A,e)。当模板分子TBHQ被洗脱后(MIP/MWCNT/GCE),在印迹膜表面产生大量的空穴,有利于离子和电子扩散到电极表面[38],因此K3[Fe(CN)6]氧化还原峰显著增强(图6A,d),说明所制备的传感器具有很好的导电性。

电化学阻抗是研究电极表面修饰材料的界面性质以及电子转移阻抗的重要手段。从图6B中的Nyquist阻抗谱看到,GCE的EIS图谱(图6B,a)包括高频区的半圆部分和低频区的直线部分,说明在电极表面发生的电极过程是由电化学反应(电荷传递)和扩散过程(反应物或产物的扩散)混合控制的[39-40]。在GCE表面修饰MWCNT后,高频区半圆消失(图6B,b),说明电极表面的电阻值显著降低,导电性增强,电极过程主要由扩散控制。TBHQ-MIP/MWCNT/GCE (图6B,c)和NIP/MWCNT/GCE (图6B,e)具有与GCE相似的EIS图谱,只是半圆的直径更大,说明电阻增大,电荷传递速度减慢,其原因与图6A分析的结果一致。洗脱TBHQ模板分子后,印迹空穴的形成传质和电子转移提供了有效通道,MIP/MWCNT/GCE (图6B,d)的EIS图谱半圆消失,电阻值减小,导电能力增强。

2.5 线性范围测试

图7A为所制备的MIP/MWCNT/GCE在含不同浓度TBHQ的PBS溶液中的DPV响应结果。显然,随着TBHQ浓度的增加,DPV的峰电流逐渐增强,这是由于随着目标分子TBHQ浓度增加时,有更多的TBHQ分子通过MIP膜中的印迹空穴扩散到达电极表面,实现电化学反应。图7B为对应TBHQ的线性校准曲线,分别在2×10-8～1×10-5mol·L-1和1×10-5～1×10-4mol·L-1范围内,TBHQ的峰电流随浓度增大呈线性关系[41],R2分别为0.995和0.996,检出限是1×10-8mol·L-1(S/N=3)。

Fig.7 DPVs (A) and the corresponding linear fitting (B) of the prepared MIESin the PBS solution with different TBHQ concentration图7 MIES在不同浓度TBHQ的PBS溶液中(pH=7)的DPV图(A)及相应的线性拟合图(B)

2.6 特异选择性

图8为MIP/MWCNT/GCE和NIP/MWCNT/GCE对含浓度均为5×10-6mol·L-1的TBHQ和其他干扰物的DPV响应。从图中明显看出,与BHT、EPHB和PPHB相比,MIP/MWCNT/GCE对TBHQ分子显示很好的选择性,其峰电流值是其他结构类似干扰物的4倍以上。但是,MIP/MWCNT/GCE对PG的响应要高于其他物质,这可能是由于PG分子比其他物质更易发生氧化还原反应。此外,NIP/MWCNT/GCE对5种物质的DPV响应的峰电流值差别不大,说明对TBHQ分子的印迹没有特异选择性。

Fig.8 Current responses of the TBHQ-imprinted sensor to TBHQ BHT,PG,EPHB and PPHB图8 MIES对TBHQ、BHT、PG、EPHB和PPHB(浓度均为5×10-6mol·L-1)响应电流

2.7 重复使用性和稳定性

通过多次洗脱后测试研究该传感器的重复使用性,制备MIP/MWCNT/GCE在含5×10-6mol·L-1TBHQ的PBS缓冲溶液中测试DPV响应,电化学测试后利用乙醇浸泡洗脱MIP中的模板TBHQ,红外灯下烘干,重新进行DPV测试,重复10次。实验结果显示:第10次检测TBHQ的峰电流减小了95%,10次测试的相对标准偏差为4.32%,说明MIP/MWCNT/GCE传感器具有很好的重复使用性。

MIES的稳定性直接关系到检测的效果,本实验通过测定放置一段时间后的MIP/MWCNT/GCE对5×10-6mol·L-1TBHQ的电流响应性表征该传感器的稳定性。将制备好的 MIP/MWCNT/GCE 放置7 d后,其峰电流响应降低至原来的96%,放置14 d后,降为原来的95%,多次测试的相对标准偏差为3.16%,显示该传感器稳定性好。

2.8 实际样品中TBHQ测试

通过加标回收法[42-43]检测实际样品中TBHQ的含量。MIP/MWCNT/GCE对3种方便面中TBHQ含量的检测结果如表2,对TBHQ的加标回收率在93%～102%,相对标准偏差1.62%～3.30%。

表2 实际样品中TBHQ的检测(n=3)

3 结论

本文采用一步电聚合法在碳纳米管表面构建了TBHQ分子印迹电化学传感器MIP/MWCNT/GCE,并研究了传感器的线性响应范围和实际应用性。构建的TBHQ分子印迹电化学传感器对TBHQ线性检测范围分别是2×10-8～1×10-5mol·L-1和1×10-5～1×10-4mol·L-1,线性相关系数分别为0.995和0.996,检出限为1×10-8mol·L-1(S/N=3)。与TBHQ结构相似的抗氧化剂PG、BHT、EPHB和PPHB等相比,该MIES对TBHQ的响应电流是其他类似物质的4倍左右,显示良好的特异选择性,且重复使用性和稳定性较好。利用该分子印迹电化学传感器研究实际样品中TBHQ的含量,加标回收率为93%～102%,能避免实际食品中其他物质的干扰,有针对性的检测TBHQ含量。