微生物絮凝剂产生菌的鉴定及絮凝特性研究

武晓畅,郑靖凡,李日强,曲睿娟,王小琴

(山西大学 环境与资源学院,山西 太原 030006)

目前,絮凝法在污水处理中应用非常广泛[1],按其成分可分为有机絮凝剂、无机絮凝剂和生物絮凝剂。单独使用无机絮凝剂时往往投药量较大,致使运行费用较高,同时单独使用无机絮凝剂时污泥量较大,处理不当极易成为二次污染。有机絮凝剂往往具有致突变、致癌、致畸作用并且属于难生物降解物质。但是微生物絮凝剂具有高效、无毒、无二次污染、可生物降解等特点,属于环境友好型材料引起了人们的关注[2-4]。

最早的絮凝剂产生菌是从活性污泥中筛选得到,目前絮凝剂产生菌的主要来源依然是从土壤、活性污泥中筛选获得。细菌、放线菌、真菌及藻类等微生物都能产生微生物絮凝剂,但由于不同微生物分泌的絮凝剂性质不同,且微生物絮凝剂的成分复杂,目前为止人们对于微生物絮凝机理尚缺少一个较为清楚的解释,在实际生产应用中往往造成不必要的浪费。对微生物絮凝机理假说大概分为:吸附架桥机理、电性中和机理、化学反应机理。

微生物絮凝剂的絮凝活性会受到絮凝体系条件的影响,已有大量的文献对微生物絮凝剂的絮凝特性进行了研究[5-9]。本研究利用从土壤中分离出的两株高效微生物絮凝剂产生菌PY-M3和PY-F6,研究了絮凝剂的添加量、高岭土的浓度、水的pH值、助凝剂的种类、助凝剂的添加量、沉淀时间对絮凝效果的影响并对菌株进行了鉴定。

1 材料与方法

1.1 材料

试验用微生物絮凝剂产生菌株(PY-M3和PY-F6)为本实验室从土壤中筛选获得的;

发酵培养基:葡萄糖20 g,KH2PO42 g,K2HPO45 g,(NH4)SO20.2 g,NaCl 0.1 g,脲0.5 g,酵母膏0.5 g,MgSO4·7H2O 0.2 g,蒸馏水1 000 mL,pH 7.0,112℃灭菌30 min;

助凝剂选用质量分数为1%的AlCl3、MgSO4、CuSO4、MnSO4、FeSO4、NaCl、KCl和CaCl2溶液。

1.2 微生物絮凝剂制备

在装有50 mL发酵培养基的150 mL三角瓶中分别接种从两菌株斜面挑取的菌体,放入培养箱,120 r/min、30℃恒温振荡培养1 d,制得预发酵培养液。然后在装有50 mL发酵培养基的150 mL三角瓶中分别将制得的两种预发酵培养液以2%的体积比接种,放入培养箱,120 r/min、30℃恒温振荡培养3 d,制得微生物絮凝剂备用。

1.3 微生物絮凝剂在絮凝处理高岭土溶液时的影响因素

1.3.1 微生物絮凝剂添加量对絮凝效果的影响

取100 mL浓度为4 g/L的高岭土悬浊液于200 mL的烧杯中,调节pH值为7,分别投加0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、3.5、4.0、5.0 mL絮凝剂和5 mL质量浓度为1%的CaCl2溶液,待反应结束后静置沉淀20 min,测定絮凝率,重复3次,取平均值。

1.3.2 pH值对絮凝效果的影响

取100 mL浓度为4 g/L的高岭土悬浊液于200 mL的烧杯中,调节pH值分别为4、5、6、7、8、9、10、11,投加3 mL絮凝剂和5 mL质量浓度为1%的CaCl2溶液,待反应结束后静置沉淀20 min,测定絮凝率,重复3次,取平均值。

1.3.3 高岭土悬浊液浓度对絮凝效果的影响

分别取100 mL浓度为1、2、3、4、5、6、7、8 g/L的高岭土悬浊液于200 mL烧杯中,调节pH值为8,投加3 mL絮凝剂和5 mL质量浓度为1%的CaCl2溶液,待反应结束后静置沉淀20 min,测定絮凝率,重复3次,取平均值。

1.3.4 不同阳离子对絮凝效果的影响

取100 mL浓度为3 g/L的高岭土悬浊液于200 mL烧杯中,调节pH值为8,分别投加3 mL絮凝剂和5.0 mL质量浓度为1%的不同助凝剂溶液,待反应结束后静置沉淀20 min,测定絮凝率,重复3次,取平均值。

1.3.5 CaCl2投加量对絮凝效果的影响

取100 mL浓度为3 g/L的高岭土悬浊液于200 mL烧杯中,调节pH值为8,分别投加 1.0、2.0、3.0、4.0、5.0、6.0、7.0、8.0 mL质量浓度为1%的CaCl2溶液和3 mL絮凝剂,待反应结束后静置沉淀20 min,测定絮凝率,重复3次,取平均值。

1.3.6 沉淀时间对絮凝效果的影响

取100 mL浓度为3 g/L的高岭土悬浊液于200 mL烧杯中,调节pH值为8,投加3 mL絮凝剂和质量浓度为1%的CaCl2溶液(PY-F6絮凝剂为2 mL,PY-M3絮凝剂为3 mL),待反应结束后静置沉淀5、10、15、20、25、30、35、40 min,测定絮凝率,重复3次,取平均值。

1.4 菌株的鉴定

根据细菌通用引物序列设计PCR反应的引物,进行PCR扩增,PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳检测,最后对PCR产物进行回收纯化直接进行测序[10],将所测结果提交至GenBank并进行对比分析,对菌株进行鉴定。

1.5 测定项目与方法

絮凝率的测定[11]:在100 mL量筒中,分别加入80 mL蒸馏水,5 mL质量浓度为1%的CaCl2溶液和不同量微生物絮凝剂粗品,然后加水至100 mL。在200 mL烧杯中,称取0.40 g高岭土,将量筒中液体倒入烧杯中,调pH值至8.0左右,用搅拌器快速搅拌30 s(200 r/min),慢速搅拌5 min(50 r/min),静置10 min后,用721型分光光度计测定上清液在波长为550 nm处的吸光度,同时以蒸馏水代替菌液和CaCl2作为对照,用下面的公式计算待测样品的絮凝率:

絮凝率(%)=(A-B)/A×100%

(1)

式中：A:对照上清液在550 nm处的吸光度,B:样品上清液在550 nm处的吸光度。

絮凝活性分布的测定[12]:将一定量发酵液在5 000 r/min离心30 min,取出菌体,用蒸馏水洗涤2次后置于与发酵液等体积的蒸馏水中,摇匀制成菌体细胞悬浮液。分别测定发酵原液(含细胞)、发酵上清液以及菌体细胞悬浮液的絮凝效率。

絮凝剂的热稳定性[13]:取50 mL的发酵液,在沸水浴中加热5、10、15、20、25、30 min,通过测定发酵液在不同加热时间下的絮凝效率来确定絮凝剂的热稳定性。

Fig.1 Effect of MBF dosage on flocculation efficiency图1 微生物絮凝剂添加量对处理效果的影响

2 结果与讨论

2.1 微生物絮凝剂添加量对絮凝效果的影响

絮凝剂的添加量直接影响絮凝效果,试验分别考察了两种微生物絮凝剂添加量对高岭土悬浊液絮凝效果的影响，结果见图1。

由图1可知,两种絮凝剂的絮凝率都是随着添加量的增加而逐渐增大,PY-F6絮凝剂在添加量为30 mL/L时絮凝率达到最大97.84%。随着添加量的继续增加,絮凝率呈下降趋势,但趋势不明显,PY-M3絮凝剂在投加量为30 mL/L时絮凝率达到最大92.72%。当投加量超过30 mL/L后絮凝率出现显著下降,这可能是由于絮凝作用主要通过吸附架桥作用来絮凝水体中的胶体污染物,当加入过量微生物絮凝剂时,高分子物质将胶体粒子包裹起来,影响其脱稳和凝聚,使得絮凝效果变差[14]。

2.2 水的pH值对絮凝效果的影响

试验考察了两种絮凝剂在不同pH条件下絮凝率的变化,结果见图2。

Fig.2 Effect of pH on flocculation efficiency图2 水的pH对处理效果的影响

由图2可见, 在不同pH条件下,两种絮凝剂的絮凝率变化较大,pH在4～7时两种絮凝剂的絮凝效果较差。当pH为8时,絮凝效果最好,絮凝率分别为92.57%和95.95%。pH大于8絮凝率有缓慢下降的趋势,但变化不明显,说明本试验中的两种微生物絮凝剂在偏碱性条件下效果好。这可能因为pH影响表面电荷、带电状态以及中和电荷能力,在pH值较高的状态下,胶体颗粒表面电荷降低,使得颗粒间排斥作用减弱,促进架桥形成和颗粒沉淀[15]。

2.3 高岭土溶液浓度对絮凝效果的影响

改变高岭土的浓度分别为 l、2、3、4、5、6、7和8 g/L,考察在不同悬浊液浓度下两种絮凝剂的絮凝效果,结果见图3。

Fig.3 Effect of concentration of Kaolin on flocculation efficiency图3 高岭土溶液浓度对处理效果的影响

由图3可见,随着高岭土溶液浓度的增加,两种絮凝剂的絮凝率都不断上升,在高岭土溶液的浓度为3 g/L时絮凝率达到最大,分别为92.32%和94.06%。当高岭土溶液浓度继续增加时,絮凝率都呈下降的趋势。这可能是由于当高岭土溶液浓度较低时,胶体物质较少,絮凝剂与胶体之间通过吸附架桥作用完成沉降,当高岭土溶液浓度相对较高时,絮凝剂在溶液中的浓度相对降低,所能提供的结合位点较少,从而导致无法形成足够的吸附架桥作用进行絮体团聚沉降[16]。

2.4 不同助凝剂对微生物絮凝剂絮凝效果的影响

选择8种不同的阳离子作为助凝剂。通过对比单独添加微生物絮凝剂的絮凝效果、单独添加不同助凝剂的絮凝效果和两者混合起来的絮凝效果,考察不同助凝剂对微生物絮凝剂絮凝效果的影响,见表1。

表1 不同助凝剂对微生物絮凝剂絮凝效果的影响

由表1可知,如果不添加助凝剂,两种微生物絮凝剂的絮凝效果均不理想,PM-Y3絮凝剂絮凝效率仅为60%。加入Na+,K+后,絮凝效果受到抑制。加入Al3+、Mn2+、Mg2+、Fe2+、Ca2+、Cu2+后絮凝效果有一定的提升,Mn2+、Fe2+、Cu2+本身具有较好的絮凝作用,加入微生物絮凝剂中对絮凝效果的提升不明显,而Al3+、Mg2+、Ca2+自身絮凝效果较差,但对微生物絮凝剂的助凝效果良好,且Ca2+对微生物絮凝剂的助凝效果最好。一般来说,金属阳离子在絮凝剂中的作用主要是压缩双电层,二价阳离子可在絮凝剂分子与胶体颗粒间以离子键结合而促进絮凝发生;一价阳离子不能同时与胶体颗粒及絮凝剂键合,只能与其中之一结合而不利于絮凝作用的发生;三价阳离子可能由于离子强度过高,大量离子占据絮凝分子的活性位点,并把絮凝分子与胶体颗粒隔开而抑制絮凝[17]。

2.5 CaCl2投加量对絮凝效果的影响

在上述试验基础上选用助凝效果最好的CaCl2进行试验,考察不同CaCl2投加量对絮凝效果的影响。结果如图4。

Fig.4 Effect of CaCl2dosage on flocculation efficiency图4 CaCl2投加量对絮凝效果的影响

由图4可知,CaCl2投加量对于PY-M3和PY-F6两种絮凝剂的絮凝效果都有明显提升。当CaCl2投加量为10 mL/L时,Ca2+在体系中的浓度较低,对两种絮凝剂絮凝效果的提升均不明显。随着CaCl2投加量的增加,絮凝效果均出现大幅度提升。当CaCl2投加量为20 mL/L时,PY-F6絮凝率达到94.8%。当CaCl2投加量为30 mL/L时,PY-M3的絮凝率达到92.9%,之后CaCl2投加量继续增加时,絮凝效果逐渐下降,与之前的研究结果[18]相一致。

2.6 沉淀时间对絮凝效果的影响

对静置沉淀时间在5-40 min时的絮凝效果进行测定,结果如图5。

Fig.5 Effect of resting time on flocculation efficiency图5 沉淀时间对絮凝效果的影响

由图5可知,PY-F6絮凝剂在静置20 min时絮凝率达到99%,且沉降速度非常快。PY-M3絮凝剂的沉降过程相对较慢,静置40 min时絮凝率达到96%。

2.7 絮凝活性分布及絮凝剂的收获

测定微生物菌株的培养液、离心去除微生物细胞后的上清液和微生物细胞的菌悬液的絮凝率,结果见图6。

Fig.6 Distribution of flocculation efficiency图6 微生物菌株培养液絮凝活性分布

从图6可知,PY-F6菌株上清液的絮凝率为96.7%,PY-M3菌株上清液的絮凝率为92.2%,可见两种微生物絮凝剂的絮凝活性成分都主要分布在上清液中,说明发挥絮凝作用的主要成分是菌体细胞分泌的胞外代谢产物而非菌体本身。

将两种菌株的发酵液离心30 min(5 000 r/min),取上清液与3倍体积的乙醇充分混合后在4℃下放置8 h,将形成的沉淀物离心30 min(5 000 r/min)收集,烘干称重,PY-F6发酵液制得的絮凝剂粗品为1.51 g/L,PY-M3制得絮凝剂粗品为0.87 g/L。

2.8 微生物絮凝剂的热稳定性

测定在沸水浴中加热不同时间后两种微生物絮凝剂各自的絮凝率变化,考察其热稳定性并推断起絮凝作用的活性成分的主要构成,结果见图7。

Fig.7 Effect of heat-up time on flocculation efficiency图7 不同加热时间对絮凝效果的影响

由图7可知,加热5 min,两种微生物絮凝剂的絮凝率都上升,PY-F6絮凝剂的絮凝率为96.22%,PY-M3絮凝剂的絮凝率为93.92%,从反应动力学的解释可能是随着温度的上升,胶体粒子和悬浮物质的运动速度加快,从而促进悬浮颗粒与絮凝剂分子之间化学键的形成[19]。PY-F6絮凝剂的絮凝率随加热时间的增加而改变的幅度较小,热稳定性较好,其主要成分可能是多糖类,而PY-M3絮凝剂的絮凝率随着加热时间的增加出现明显的下降,热稳定性较差,其主要成分可能是蛋白质或者核酸[20-21]。

2.9 菌株鉴定

菌株PY-F6在高氏1号平板上的生长状态为圆形、边缘整齐、中心淡紫色外圈白色、粉质状、菌落较小,有气味。

将扩增16srRNA基因片段的PCR产物利用试剂盒进行回收纯化,之后将回收纯化后的产物进行序列测定,测序结果为:

将该序列提交至GenBank进行比对,找出其最相似序列(表2)。

表2 GenBank中与絮凝菌PY-F6的16SrRNA基因最相似的序列

根据比对结果,PY-F6菌株可以鉴定为黄三素链霉菌(Streptomycesflavotricini)。

3 结论

(1)微生物絮凝剂在不同条件下对高岭土溶液的絮凝研究表明,试验所用菌株PY-F6和PY-M3产絮凝剂的最佳絮凝条件为,絮凝剂添加量为30 mL/L，pH为8，高岭土溶液浓度为3 g/L，Ca2+的助凝效果最好，质量浓度为1%的CaCl2投加量为20 mL/L(PY-F6絮凝剂)和30 mL/L(PY-M3絮凝剂)，静置沉淀时间为20 min(PY-F6絮凝剂)和40 min(PY-M3絮凝剂)。在最佳絮凝条件下,PY-F6絮凝剂的絮凝率达到99%,PY-M3絮凝剂的絮凝率达到96%。

(2)絮凝活性分布及絮凝剂的收获研究表明,两种微生物絮凝剂的絮凝活性成分都主要分布在上清液中,发挥絮凝作用的主要成分是菌体细胞分泌的胞外代谢产物而非菌体本身。PY-F6发酵液制得的絮凝剂粗品为1.51 g/L,PY-M3制得絮凝剂粗品为0.87 g/L。

(3)热稳定性研究表明,PY-M3絮凝剂的热稳定性较差,PY-F6絮凝剂的热稳定性较好。

(4) PY-F6菌株可以鉴定为黄三素链霉菌。