腹腔注射去甲肾上腺素小鼠心肌组织形态学、容积调节性氯离子通道蛋白3表达变化及其意义

陈梦青，黄丹,2，孙宇，汪帅，李春梅

(1 广东药科大学，广州510006；2 湖南中医药高等专科学校)

心肌肥厚是心肌梗死、心律失常、心绞痛、心衰等心血管疾病的主要危险因素，但其发生发展的机制尚不清楚[1～3]。容积调节性氯离子通道蛋白3(ClC-3)是电压门控氯离子通道基因家族成员，在心房和心室细胞中的含量丰富[4]。我们的前期研究[5]显示，在儿茶酚胺类物质去甲肾上腺素(Norepinephrine,NE)诱导的大鼠心肌细胞心肌肥厚模型中，ClC-3表达显著降低。本研究观察了腹腔注射NE及其拮抗剂酚妥拉明(Phentolamine，Phe)对小鼠心肌组织形态学的影响，并检测心肌细胞内ClC-3及心肌肥厚标志物心房钠尿肽(ANF)的表达，以探讨NE诱导小鼠心肌肥厚的机制。

1 材料与方法

1.1 小鼠及主要试剂 C57BL/6小鼠购自北京维通利华实验动物技术有限公司，动物合格编号：SCXK(京)2012-0001，饲养于SPF级环境中。NE、Phe购自美国Sigma公司。TRIzol购自TaKaRa生物公司。PCR引物由生工生物工程有限公司设计并合成，Prime ScriptTMRT Reagent及SYBR PCR Mix购自ToYoBo公司。

1.2 小鼠分组及给药方法 选取27只六周龄雄性C57BL/6小鼠并随机分为NE组、Phe+NE组、对照组，每组9只。NE组小鼠每天腹腔注射NE(2 mg/kg)；Phe+NE组小鼠每天先腹腔注射Phe(8 mg/kg)，2 h后再腹腔注射NE(2 mg/kg)[6,7]；对照组小鼠每天腹腔注射等量生理盐水。

1.3 各组小鼠心脏指数测算及心肌组织形态学观察 所有药物连续注射7 d后，测算各组小鼠心脏指数并观察心肌组织形态学变化。①各组小鼠给药结束后禁食1 d，记录其体质量，然后用10%水合氯醛麻醉，用眼科剪及镊子迅速取出心脏组织，清洗并称量心脏重量，计算心脏指数。心脏指数=心脏重量/体质量。②取心肌组织，用4%甲醛液固定，制成石蜡切片，60 ℃烘烤2 h，常规脱蜡，HE染色，脱水，封片，显微镜下观察并拍照。

1.4 各组小鼠心肌组织中ClC-3和ANF mRNA的检测 取各组小鼠心肌组织，冰上剪碎，用预冷PBS清洗至上清澄清，TRIzol法提取心肌组织总RNA，逆转录合成cDNA，以GAPDH为内参，Real-time PCR法检测心肌组织ClC-3和ANF mRNA的相对表达量。引物序列如下：ClC-3上游引物5′-CCCGAGGTGGAGAGAGACTGCT-3′,下游引物为5′-CCGGCTTTCAGAGAGGTTACG-3′；ANF上游引物为5′- TAGGAGACAGTGACGGACAA-3′,下游引物为5′-GAAGAAGCCCAGGGTGAT-3′； GAPDH上游引物为5′-GGCATGGACTGTGGTCATGA -3′,下游引物为5′-TTCACCACCATGGAGAAGGC-3′。PCR反应体系：SYBR MIX 10 μL、上游引物1 μL、下游引物1 μL、cDNA 2 μL、ddH2O 6 μL。以2-ΔΔCt表示目的基因mRNA的相对表达量。

1.5 各组小鼠心肌组织中ClC-3蛋白的检测 采用Western blotting法。取各组小鼠心肌组织，冰上剪碎，用预冷的PBS清洗至上清澄清，按50 mg/mL加入裂解液，冰上匀浆后4 ℃、12 000 r/min离心12 min，取上清，BCA法定量。制备10% SDS-PAG，电泳分离蛋白，电转移至PVDF膜上，脱脂奶粉封闭2 h，一抗4 ℃孵育过夜，二抗室温孵育1 h，ECL发光液浸泡1 min后，以GAPDH为内参，采用凝胶成像系统检测各组小鼠心肌组织中ClC-3蛋白的相对表达量。ClC-3蛋白的相对表达量=ClC-3蛋白的平均光密度值/GAPDH蛋白的平均光密度值。

2 结果

2.1 各组小鼠心脏指数比较及心肌组织形态学变化 ①NE组、Phe+NE组、对照组小鼠心脏指数分别为5.22±0.46、4.80±0.23、4.61±0.25，NE组与Phe+NE组、对照组相比，P均<0.05。②NE组小鼠心肌细胞和心肌肌束排列异常，心肌细胞及细胞核异常肥大、变形，细胞核聚集，出现明显的心脏重构、心肌细胞增大现象，提示小鼠出现心肌肥厚；Phe+NE组、对照组小鼠心肌细胞正常，心肌细胞排列有序，无核聚集现象，见图1。

2.2 各组小鼠心肌组织中ClC-3和ANF mRNA的表达比较 NE组、Phe+NE组、对照组小鼠心肌组织中ClC-3 mRNA的相对表达量分别为0.50±0.10、1.16±0.38、1.00±0.00，NE组与Phe+NE组、对照组相比，P均<0.01。NE组、Phe+NE组、对照组小鼠心肌组织中ANF mRNA的相对表达量分别为2.95±1.78、1.96±0.75、1.00±0.00，NE组与Phe+NE组、对照组相比，P均<0.05。

2.3 各组小鼠心肌组织ClC-3蛋白的表达比较 NE组、Phe+NE组、对照组小鼠心肌组织中ClC-3蛋白的相对表达量分别为0.46±0.02、0.68±0.02、0.69±0.04，NE组与Phe+NE组、对照组相比，P均<0.05。

3 讨论

心肌肥厚是威胁人类健康的常见疾病，主要的病理变化表现为心肌重构，包括心脏重量增加、心肌细胞体积增大、心脏成纤维细胞增殖、心间质纤维化和ANF、脑钠肽、β-肌球蛋白重链等心肌肥厚标志物的升高[8]。心肌肥厚的发生机制十分复杂，人们对心肌肥厚发生的确切分子机制仍不清楚。研究[9]显示，诱导心肌肥厚发生的因素有很多，儿茶酚胺、机械性因素、神经体液、细胞因子、血流动力学等因素都能诱导心肌肥厚的发生。研究[10]表明，NE刺激可导致大鼠心肌肥厚和纤维化的发生。NE作为交感神经末梢释放的重要递质，可通过α-肾上腺素能受体介导心肌肥厚及ANF的表达升高。本研究发现，小鼠连续腹腔注射NE 7 d后心脏指数显著升高，组织形态学观察显示小鼠出现明显的心脏重构、心肌细胞增大现象，且心肌肥厚标志物ANF mRNA显著升高，而NE拮抗剂Phe的加入能明显改善这一现象。

研究[11]表明，容积调节性氯离子通道参与了心肌细胞容积调节和细胞凋亡，对缺血的心肌细胞具有保护作用。ClC-3是容积调节性氯离子通道基因家族成员之一，在各类动物体内广泛表达。研究[4]表明，ClC-3可以通过容积调节性氯离子电流参与细胞容积调节，从而调节细胞兴奋性、细胞迁移、细胞器酸化、细胞的增殖与分化等。Xiong等[12]发现，特异性敲除小鼠心脏ClC-3基因会诱导心肌肥厚和心力衰竭的发生发展，提示ClC-3与心肌肥厚的发生有一定关系。另外，在扩张型心肌病的犬和主动脉结扎诱导的心肌肥厚小鼠中，均发现心肌细胞的容积调节性氯离子电流持续激活。因此，我们课题组前期进行了细胞研究[5]，发现在NE诱导的大鼠心肌细胞中，ClC-3的表达明显降低。现进一步进行动物实验，结果发现，连续注射NE 7 d后，NE组小鼠心肌细胞和心肌肌束排列异常，心肌细胞及细胞核异常肥大、变形，细胞核聚集，出现明显的心脏重构、心肌细胞增大现象，提示NE可诱导小鼠出现心肌肥厚。进一步检测发现，与对照组相比，NE组小鼠心肌组织中ClC-3 mRNA和蛋白的表达均显著降低，而Phe能拮抗此作用，进一步验证ClC-3的降低与NE诱导的心肌肥厚有一定的关系。

综上所述，NE可诱导小鼠心肌肥厚，其机制可能与其抑制ClC-3 mRNA和蛋白的表达有关。