抗番茄灰霉病菌的内生短短芽孢杆菌W4菌株发酵条件优化

杨从军

（青岛农业大学植物医学学院，山东省农作物病虫害综合防控重点实验室，山东青岛 266109）

灰霉病是世界范围内普遍发生和广泛分布的植物病害之一，严重危害蔬菜、水果等园艺植物生产，基于其科学和经济价值，灰霉病菌（Botrytis cinerea）被排在最重要的植物病原真菌第2位（Dean et al.，2012；Shin et al.，2017）。对灰霉病的防治常常依赖于化学杀菌剂的频繁使用，但灰霉病菌是一种经典的高风险病原（Hahn，2014），已对多种杀菌剂产生抗性，如苯并咪唑类、苯氨基嘧啶类、二甲酰亚胺类、甾醇生物合成抑制剂等（Elad，1992；Baroffio et al.，2003；Zhao et al.，2010）。因此，筛选利用拮抗微生物或其活性代谢产物防治灰霉病成为研究热点（Choi et al.，2009；Compant et al.，2013；Rana et al.，2016）。

菌株W4是从番茄茎中分离筛选到的1株内生细菌，其发酵液稀释10倍可完全抑制番茄灰霉病菌菌丝生长，根据形态、生理生化、16S rDNA序列和Biolog系统分析，W4菌株被鉴定为短短芽孢杆菌（Brevibacillus brevis）（Yang et al.，2011）。但模式种可利用葡萄糖和甘露糖发酵产酸，而W4菌株却不能利用这两种糖，因此被命名为Brevibucillus brevisW4（Yang et al.，2011）。 同时，Brevibucillus brevisW4菌株（以下简称W4菌株）发酵液还对金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）、枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）、水稻白叶枯病菌（Xanthomonas oryzae）、大白菜软腐病菌（Erwinia carotovora）、姜瘟病菌（Pseudomonas solanacarum）、 柑橘溃疡病菌（Xanthomonas axonopodis）6种细菌均有抑制活性（杨从军 等，2011）。为提高W4菌株发酵液活性，本试验对W4菌株培养基成分及发酵条件进行优化，以确定适合摇瓶培养的最佳方案，为抑菌活性的进一步研究开发奠定基础。

1 材料与方法

1.1 试验材料

试验于2017年9～12月在青岛农业大学农药学实验室进行。供试菌种短短芽孢杆菌W4菌株（Brevibucillus brevisW4），番茄灰霉病菌（Botrytis cinerea）均由青岛农业大学农药学实验室保存。

供试细菌培养基：牛肉膏蛋白胨培养基（NA或NB）；病原真菌培养基：PDA培养基。

碳源：果糖、丙三醇、腺苷、吐温-40。氮源：蛋白胨、牛肉膏、酵母浸膏、大豆蛋白胨。无机盐：氯化钠、硫酸铵、碳酸钙、硫酸镁、磷酸二氢钠。以上试剂均为分析纯。

1.2 发酵液抑菌活性测定方法

采用菌丝生长速率法测定发酵液的抑菌活性。取W4菌株发酵液，在4 ℃、10 000 r·min-1下离心10 min，上清液经0.22 μm微孔滤膜过滤。将3 mL发酵滤液与已灭菌并融化冷却至50 ℃的PDA培养基42 mL混合均匀，即将发酵滤液稀释15倍，平均倾入3个直径为9 cm的培养皿内，每个处理3次重复。挑取直径6 mm的番茄灰霉病菌菌饼，使菌丝朝下，放于凝固的PDA平板中央。将接菌平板倒置于霉菌培养箱中，28 ℃恒温培养。以加入3 mL无菌水的培养基为对照。一定时间后采用十字交叉法测量菌落直径，以其平均值代表菌落大小，计算抑制率。

1.3 W4菌株发酵培养基配方优化

碳源选择：在NB培养基中分别加入不同浓度的果糖、丙三醇、腺苷、吐温-40，其他成分保持不变，发酵后测定对灰霉病菌的抑制作用。

氮源选择：分别以蛋白胨、酵母浸膏、牛肉膏、大豆蛋白胨不同含量代替NB培养基中的牛肉膏和蛋白胨，其他成分保持不变，发酵后测定抑菌活性。

无机盐选择：在NB培养基中分别添加不同浓度的 NaCl、（NH4）2SO4、CaCO3、MgSO4、NaH2PO4，其他成分保持不变，发酵后测定抑菌活性。

培养基配方正交设计优化：根据单因素试验将选择出的果糖、蛋白胨和NaCl 3个因素，按L9（34）正交表优化发酵培养基配方。按以上处理分别配制培养基，并调节pH值为7.4，装液量为30 mL（100 mL三角瓶），接种量1%（体积分数，下同）。30 ℃，170 r·min-1振荡培养24 h。

1.4 W4菌株发酵条件优化

采用优化培养基，对W4菌株发酵的初始pH值、接种种龄、接种量、装液量、发酵温度、摇床转速、发酵时间进行优化。每次将优化后的结果应用于下一因素的优化中。初始pH值：3.0、4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0、10.0、11.0、12.0；接种种龄：12、16、20、24、28、32、36、40 h；接种量：1%、2%、5%、10%、15%、20%；装液量（250 mL三角瓶）：30、40、60、80、100、120 mL；发酵温度：28、30、32、35、37 ℃；摇床转速：110、130、150、170、190 r·min-1；发酵时间：12、24、36、48、60、72、84 h。

1.5 优化培养条件的抑菌活性对比

采用最佳培养基配方及最佳发酵条件对W4菌株进行发酵培养，发酵滤液稀释25倍后按1.2.1的方法测定其对番茄灰霉病菌的抑制活性，以原始发酵条件为对照，比较抑菌率大小。

1.6 数据分析

采用IBM SPSS Statistics软件进行差异显著性分析，采用Microsoft Excel软件作图。

2 结果与分析

2.1 W4菌株发酵培养基配方优化

2.1.1 碳源对W4菌株发酵液抑菌活性的影响 在发酵基础培养基中加入不同碳源，W4菌株发酵液对番茄灰霉病菌的抑菌活性差异明显。以1.0%果糖作碳源，抑菌活性最好，抑制率为100.0%，显著高于其他处理（图1）。

图1 碳源对W4菌株发酵液抑菌活性的影响

2.1.2 氮源对W4菌株发酵液抑菌活性的影响 在发酵基础培养基中加入不同含量的氮源，W4菌株发酵液对番茄灰霉病菌的抑菌活性由高到低依次为蛋白胨、大豆蛋白胨、酵母浸膏和牛肉膏。以1.5%的蛋白胨作为氮源时抑菌作用最强，抑制率达98.0%，显著高于其他处理（图2）。

图2 氮源对W4菌株发酵液抑菌活性的影响

2.1.3 无机盐对W4菌株发酵液抑菌活性的影响不同无机盐对W4菌株发酵液抑菌活性存在较大影响。培养基中添加0.25%和0.50% NaCl的发酵液对番茄灰霉病菌的生长抑制率分别达95.6%、92.3%，较有利于抑菌活性物质的产生，添加CaCO3和MgSO4的发酵液抑菌效果较差（图3）。

2.1.4 发酵培养基正交设计优化 采用正交设计试验对培养基中果糖、蛋白胨和NaCl浓度进行优化（表1），以发酵液的抑菌率为评价标准，本试验的9个处理中，对番茄灰霉病菌生长抑制活性最好的培养基组合为A2B3C1，抑制率达98.2%；而正交优化最佳处理为A2B3C2，即蛋白胨2.0%、果糖1.0%、NaCl 0.25%为培养基最优配方组合。由极差R值的大小可以看出，3种成分对菌株发酵液抑菌活性影响的大小顺序为蛋白胨＞果糖＞NaCl（表1）。

图3 无机盐对W4菌株发酵液抑菌活性的影响

表1 W4菌株发酵培养基正交试验结果

2.2 W4菌株发酵条件优化

2.2.1 初始pH值对W4菌株发酵液抑菌活性的影响 初始pH值为6.0～9.0时，W4菌株发酵液对番茄灰霉病菌的抑菌活性较强，当pH值＜6.0或＞9.0时，抑菌活性显著降低（图4）。初始pH值为3.0或4.0时，发酵24 h后，W4菌株几乎没有生长，发酵液清亮透明。最佳初始pH值为8.0，发酵液对番茄灰霉病菌生长抑制率达100.0%，显著高于其他处理。

图4 初始pH值对W4菌株发酵液抑菌活性的影响

2.2.2 接种种龄对W4菌株发酵液抑菌活性的影响接种种龄为20、24、28 h时，W4菌株发酵液对番茄灰霉病菌的抑菌活性无显著差异，其中20 h时的抑制率最高，达100.0%（图5）。接种种龄＜20 h或＞28 h，发酵液抑菌活性都显著下降。综合时间和成本，适宜的接种种龄为20 h。

2.2.3 接种量对W4菌株抑菌活性的影响 无论接种的种龄为20、24 h或28 h，接种量为5%时发酵液对番茄灰霉病菌的抑制率均达到100.0%，其余接种量发酵液的抑菌活性均明显下降（图6）。因此适宜的接种量为5%。

2.2.4 装液量对W4菌株抑菌活性的影响 在装液量为40～60 mL时，发酵液对番茄灰霉病菌的抑菌率为100.0%，减少或加大装液量，抑制率均下降（图7）。装量较低可能无法满足菌体生长所需营养，而装量较大则导致溶氧减少，影响菌体生长。因此确定发酵液装液量为50 mL，可保证W4菌株充分发酵，获得更好的抑菌活性。

图5 接种种龄对W4菌株发酵液抑菌活性的影响

图6 接种量对W4菌株发酵液抑菌活性的影响

2.2.5 发酵温度对W4菌株抑菌活性的影响 随着发酵温度由28 ℃逐渐升高，发酵液抑菌活性不断增强，至35 ℃时抑菌活性最强，抑制率达98.0%。温度继续升高到37 ℃时，抑菌活性开始下降（图8）。因此，确定发酵适宜温度为35 ℃。

2.2.6 摇床转速对W4菌株抑菌活性的影响 随着摇床转速提高，发酵液抑菌活性增强，转速为150 r·min-1时的抑菌活性最强，抑制率达100.0%。转速继续增大，抑菌活性开始下降（图9）。因此，确定液体发酵时摇床的理想转速为150 r·min-1。

2.2.7 发酵时间对W4菌株抑菌活性的影响 在设定的发酵时间内，发酵24 h的抑菌率达100.0%，短于或长于24 h，发酵液抑菌活性均降低（图10）。因此理想的发酵时间为24 h。

图7 装液量对W4菌株发酵液抑菌活性的影响

图9 摇床转速对W4菌株发酵液抑菌活性的影响

2.3 优化的发酵条件对抑菌活性的影响

在优化的培养基和发酵条件下，发酵液稀释25倍对番茄灰霉病菌菌丝生长的抑制率达92.8%，比未经优化得到的发酵液（65.9%）提高了26.9个百分点，表明优化的培养基和发酵条件产生的发酵液对番茄灰霉病菌的抑制率明显提高。

图10 发酵时间对W4菌株发酵液抑菌活性的影响

3 结论与讨论

本试验确定了提高番茄内生短短芽孢杆菌Brevibacillus brevisW4菌株发酵液抑制番茄灰霉病菌活性的最适培养基和发酵条件。优化的培养基配方：蛋白胨2.0%、果糖1.0%、NaCl 0.25%；发酵条件：初始pH 8.0、接种种龄20 h、接种量5%、装液量50 mL（250 mL三角瓶）、发酵温度35 ℃、摇床转速150 r·min-1、发酵时间24 h。在优化的培养基和发酵条件下，发酵液稀释25倍对番茄灰霉病菌菌丝生长的抑制率达92.8%，比未经优化得到的发酵液提高了26.9个百分点。

不同营养成分和发酵条件的改变会影响发酵液的抑菌活性。营养成分在微生物次级代谢的起动和代谢强度方面起着重要作用，限定营养成分具有发动特异代谢和调控的作用（Elibol，2004）。发酵过程中，发酵菌株需要从环境中吸收碳源、氮源、无机盐、微量元素等一系列营养成分，通常培养基成分和抑菌化合物生物合成相关，其组成和配比对菌体生长发育、抑菌化合物产量和质量、提取效率都有相当大的影响（曹军卫 等，2007）。为获得高目标产物产量，在有效的发酵过程中设计一个合适的生产培养基是先决条件。另外，发酵过程复杂，特别是控制次级代谢产物的发酵非常困难，有时环境因素发生微小变化，目标产物就受到明显影响（Chu & Constantinides，1988）。影响因子主要包括：种龄、接种量、温度、pH值和溶氧量等，它们对发酵过程的影响各有不同，同时也会彼此影响。因此，本试验从培养基和发酵条件两方面对番茄内生菌W4菌株的发酵条件进行了优化，更有利于抑菌活性成分的产生、提取和分离。

内生菌长期生活在植物体内的特殊环境中并与宿主协同进化。一方面植物体为其提供生长必需的能量和营养；另一方面，内生菌又可以通过自身的代谢产物或借助于信号传导作用对植物体产生影响，特别在植物保护方面发挥作用（Ryan et al.，2008）。对135种分离到的代谢产物结构进行比较发现，内生菌产生新化合物的比例是51%，远高于土壤微生物产生新化合物的比例，后者仅为38%（Schulz et al.，2002）。Leslie-Gunatilaka（2006）总结了400多种来源于128种植物内生菌的天然产物，绝大部分有新的化学结构和（或）有用的生物学活性。因此，充分研究内生菌代谢产物，可能发现新的高活性化合物，开发更加有效、安全的杀菌剂（Corsini，2013）。