益气解毒化瘀小复方及其单味药对大鼠肾小球系膜细胞增殖及凋亡影响的研究

王圣治， 陈思敏， 刘英楠， 郑艳

肾小球硬化是各种原因导致肾小球损伤及病理性改变的最终结局，系膜细胞过度增殖和细胞外基质的合成增多是肾小球硬化的主要病理特征；在多种肾脏疾病的发展中，进行性的系膜细胞凋亡也是导致肾小球硬化进展的重要原因之一。在抗肾小球硬化研究方面，目前中医药在该领域研究具有一定优势及特点，仍然主要集中于抑制系膜细胞增殖和细胞外基质的积聚，促进系膜细胞凋亡方面[1]。本研究旨在探讨益气解毒化瘀消瘀方(黄芪、丹参、白花蛇舌草)及其单药组对大鼠系膜增生和凋亡的影响，并且提供理论和方法依据，为进一步研究中医药防止肾小球硬化奠定基础。

1材料与方法

1.1 动物 清洁级Wistar大鼠60只，雌雄各半，体质量(200±20)g，购买自沈阳药科大学实验动物处[许可证号：SYXK(军)2007-004]。

1.2 主要试剂 DMEM培养基干粉(美国GIBCO产品)；MTT(欣博盛生物科技有限公司)；标准胎牛血清(美国Sigma公司)；AnnexinV-FITC(欣博盛生物科技有限公司)；血管紧张素Ⅱ(美国Sigma公司)；大鼠肾小球系膜细胞(武汉博士德生物工程有限公司，编号：HBZY-1，CX0130)。

1.3 实验药物 中药饮片黄芪、丹参、白花蛇舌草由辽宁中医药大学附属医院药剂科提供；西药替米沙坦(德国勃林格殷格翰国际公司)。

1.4 方法

1.4.1 实验药物及含药血清制备 将各组中药饮片水煎煮并浓缩成相应浓度，浓度分别为黄芪0.7 g/mL，丹参0.25 g/mL，白花蛇舌草水煎0.3 g/mL，小复方组(黄芪、丹参、白花蛇舌草)1.25 g/mL，西药替米沙坦加入蒸馏水配成浓度为0.6 g/L；60只Wistar大鼠适应性饲养1周后，按随机数字表法分为正常对照组、小复方组、黄芪组、丹参组、白花蛇舌草组、替米沙坦组，每组10只；正常对照组每日灌服蒸馏水4 mL，各药物组分别早晚各一次灌服药液2 mL，连续3 d，第3天灌胃后1 h腹主动脉采血，采血后离心取得血清，于56 ℃水浴30 min，用无菌滤器进行过滤，之后冻存备用。

1.4.2 大鼠肾小球系膜细胞培养 肾小球系膜细胞常规培养于含有10%胎牛血清的DMEM培养液中，置于5%CO2，37 ℃培养箱中培养，2～3 d换液1次，当系膜细胞长至贴壁80%～90%时，磷酸盐缓冲液洗2次，25 mg/L胰蛋白酶消化、传代。

1.4.3 随机分组系膜细胞 将培养后的肾小球系膜细胞随机分为：正常对照组加入血管紧张素Ⅱ 1×10-6mol/L+正常大鼠血清DMEM液；小复方组加入血管紧张素Ⅱ 1×10-6mol/L+10%浓度小复方组大鼠血清的DMEM液；黄芪组加入血管紧张素Ⅱ 1×10-6mol/L+10%浓度黄芪组大鼠血清的DMEM液；丹参组加入血管紧张素Ⅱ 1×10-6mol/L+10%浓度丹参组大鼠血清的DMEM液；白花蛇舌草组加入血管紧张素Ⅱ 1×10-6mol/L+10%浓度白花蛇舌草组大鼠血清的DMEM液；替米沙坦组血管紧张素Ⅱ 1×10-6mol/L+10%浓度替米沙坦组大鼠血清的DMEM液；血管紧张素Ⅱ组分别加入血管紧张素Ⅱ 1×10-6mol/L+10%浓度胎牛血清的DMEM液。

1.4.4 系膜细胞增殖检测 采用MTT比色法，将生长状态良好的大鼠肾小球系膜细胞转种于96孔板，每组随机设6个复孔，待培养24 h细胞贴壁，换成无血清DMEM液，使细胞同步于G0/G1期培养24 h，然后分别加入含10%正常大鼠血清和10%含药血清，每孔200 μL，继续培养48 h后，弃去培养液，分别于培养结束前6小时加入MTT 20 μL/孔。培养结束后，移去MTT溶液，然后每孔加入150 μL二甲亚砜，用酶联免疫检测仪测吸光度值A(570 nm处)，测定各组对大鼠系膜细胞增殖的抑制作用。

1.4.5 细胞凋亡率检测 大鼠肾小球系膜细胞以1×105/mL浓度接种于培养瓶中，细胞分组分别加入含10%正常及含药大鼠血清，用800 μL含1%胎牛血清的磷酸盐缓冲液重悬细胞，加入碘化丙啶溶液100 μL和RNA酶A 100 μL，37 ℃孵育30 min，固定的样品过滤后上流式细胞仪分析细胞凋亡。

2 结果

2.1 各组对大鼠肾小球系膜细胞增殖结果 见表1。

表1 各组对大鼠肾小球系膜细胞增殖的影响

注：与正常对照组比较，aP<0.01；与血管紧张素Ⅱ组比较，bP<0.05；与小复方组比较，cP<0.05。

表1结果表明，与正常对照组比较，血管紧张素Ⅱ组能促进肾小球系膜细胞增殖水平升高，差异有统计学意义(P<0.01)，提示系膜细胞增殖模型建立成功。与血管紧张素Ⅱ组比较，各药物组对血管紧张素Ⅱ诱导的系膜细胞增殖均有抑制作用，差异有统计学意义(P<0.01)；各药物组与小复方组比较，小复方组抑制肾小球系膜细胞增殖作用最显著，差异有统计学意义(P<0.01或0.05)；其余各组之间比较差异无统计学意义(P>0.05)。药物血清在作用24、48 h之间比较差异无统计学意义(P>0.05)，表明药物抑制大鼠肾小球系膜细胞增殖作用不随时间的延长而有显著性变化。

2.2 碘化丙啶单染流式细胞仪检测分析大鼠肾小球系膜细胞凋亡率 见表2。

表2 各组对大鼠肾小球系膜细胞凋亡率的影响

注：与正常对照组比较，aP<0.05；与血管紧张素Ⅱ组比较，bP<0.05；与小复方组比较，cP<0.05。

表2结果表明，与正常对照组比较，血管紧张素Ⅱ组能降低肾小球系膜细胞凋亡率，差异有统计学意义(P<0.01)；与血管紧张素Ⅱ组比较，各药物组均能够增加系膜细胞凋亡率，差异有统计学意义(P<0.05)；各药物组与小复方组比较，小复方组抑制肾小球系膜细胞凋亡作用最显著，差异有统计学意义(P<0.01或0.05)；其余各组之间比较差异无统计学意义(P>0.05)。

3 讨论

系膜细胞是肾小球最活跃的固有细胞，除具有单核巨噬细胞的吞噬功能，还具有分泌细胞外基质、产生细胞因子(即系膜细胞的自分泌作用)等功能，因免疫反应、炎症反应、高血压等因素可刺激系膜细胞的增殖，而引起细胞外基质合成增多、成分异常，随病变进展继而引起或加重肾小球硬化，最终可导致终末期肾病[2-4]。正常生理条件下，肾小球系膜细胞的自我更新和凋亡是同时存在的，且随着研究的进展，人们意识到肾小球系膜细胞凋亡有正面作用及其负面作用[5-6]：系膜细胞异常增殖参与了诸多肾小球疾病的发生发展，通常会以白细胞浸润和系膜细胞增殖为特征，细胞凋亡可清除浸润的白细胞、过度增殖的系膜细胞及去除肾纤维化治愈后的成纤维细胞，这时的细胞凋亡有益于肾组织的重塑与肾小球结构与功能的恢复；然而在多种肾脏疾病如中毒性肾病、肾小球肾炎、梗阻性肾病的发生发展过程中，系膜细胞的凋亡使得大量细胞被清除，而致肾小球基底膜裸露及足细胞丢失、进行性的系膜细胞丢失导致肾小球硬化，缺乏细胞再生导致肾小管萎缩，这时发生的细胞凋亡则是肾小球硬化和肾功能损伤的加重因素。换言之，肾小球肾炎的特征性病理特征是炎症性细胞浸润，细胞外基质积聚和肾小球系膜细胞增殖，均导致肾小球硬化和瘢痕形成；由于肾小球系膜细胞扩张可以预示肾小球瘢痕形成，因此系膜细胞的自我更新可能是重要的。在某些形式的肾小球损伤中，肾小球系膜细胞增殖消退，肾小球结构和功能恢复正常。在系膜增生性肾小球肾炎中，系膜细胞凋亡是系膜细胞过度消退的主要修复机制[7-8]。细胞凋亡也是进行性新月体肾小球肾炎中愈合和瘢痕形成的特征[9]。这些研究表明细胞凋亡在肾小球炎症和愈合过程中很重要，但其失调可能导致瘢痕形成和进展为肾小球硬化。例如，在诸如IgA和狼疮性肾炎的肾小球疾病中，细胞耗竭是通过细胞凋亡，其随后发展为硬化[10]。增殖和凋亡之间的平衡可能是损伤期间和之后肾小球重塑的重要机制。因此，抑制系膜细胞增殖和细胞外基质的积聚，促进系膜细胞凋亡，操纵这些途径可以限制肾小球瘢痕形成，缓解肾小球硬化，保护肾脏功能方面起着重要的作用。

前期研究结果显示，小复方对转化生长因子β1基因表达具有明显的抑制作用，并抑制肾小球系膜细胞基质中合成和分泌纤维蛋白、Ⅳ胶原，增加细胞外基质降解，以有效的预防肾小球硬化[11]。最近研究结果表明，黄芪注射液对肾间质纤维化有明显改善，黄芪含药血清可减少细胞外基质的主要组成部分Ⅳ型胶原的生成，降低表达人类系膜细胞表面CD4 mRNA[12]；黄芪含药血清可通过下调核因子кB、基质金属蛋白酶-2、Fas/Fas L mRNA表达水平的作用机制，达到抑制大鼠系膜细胞增生的目的[13]；黄芪总皂苷能抑制高糖诱导下系膜细胞的过度增殖[14]。许多促炎性细胞因子参与了细胞增殖的调节，丹参可以通过干扰促炎性细胞因子产生以抑制系膜细胞增殖[15]；丹参注射液可以降低系膜细胞中纤溶酶原激活物抑制物-1 mRNA基本表达及蛋白分泌，下调转化生长因子β1分泌，提高活性氧簇水平，从而抑制细胞外基质降解，延缓肾小球硬化[16]。有研究表明，白花蛇舌草抑制血管紧张素刺激的系膜细胞外基质纤维蛋白mRNA、转化生长因子β1mRNA表达及纤维蛋白的合成，从而发挥抗肾小球纤维化的作用[17]。本实验旨在通过最佳小复方与其单味中药的比较，以确定其抗肾小球硬化的作用机制，并明确最优药物。本实验将各药物组干预后的大鼠肾小球系膜细胞进行体外培养，并选用血管紧张素Ⅱ对肾小球系膜细胞进行诱导性增殖后观察各组肾小球系膜细胞增殖及凋亡情况，从而对小复方(黄芪、丹参、白花蛇舌草)、其组成的单味药及西药替米沙坦各组进行了对比实验研究；结果表明小复方(黄芪、丹参、白花蛇舌草)组抑制大鼠肾小球系膜细胞增殖及促进系膜细胞凋亡作用最强，与各单味药组及替米沙坦比较有明显差异性。说明了中药复方在减缓肾小球系膜细胞增殖及促系膜细胞凋亡方面具有多途径、多靶点治疗的优势。本研究结果表明，黄芪、丹参、白花蛇舌草以及益气解毒化瘀小复方均可以抑制由血管紧张素Ⅱ诱导的肾小球系膜细胞增殖，其中小复方的效果最佳，其单味药组疗效无明显差异；说明益气解毒化瘀在抑制肾小球系膜细胞增殖具有优势。