传染性造血器官坏死病毒RT-LAMP检测方法的建立

韩姝伊，何亚鹏，时 晓，杜迎春

（1. 河北师范大学，河北石家庄 050024；2. 北京市水生野生动植物救护中心，北京 102100）

传染性造血器官坏死病（infectious haematopoietic necrosis，IHN）是极易对冷水鱼养殖造成严重危害的鱼类急性全身性传染病，是世界动物卫生组织（OIE）规定的须通报动物疫病，是我国的二类动物疫病、一类鱼类口岸检疫疫病[1-2]。目前，该病呈全球分布，在我国以及法国、意大利、德国、英国、日本、韩国、俄罗斯等国家均有暴发。在我国，IHN 1985年在东北地区首次报道发现，目前在北京、河北、辽宁、吉林、山东、甘肃、青海、四川、新疆、云南等地均有分布，并呈蔓延趋势[1，3]。IHN病原为弹状病毒科诺拉弹状病毒属的传染性造血器官坏死病 毒（infectious haematopoietic necrosis virus，IHNV），其形态为子弹状，有囊膜包被[2，4]。根据基因差异，IHNV可分为U、M、L、E和JRt 5个基因型，其中JRt基因型主要分布于我国以及日本和韩国等亚洲国家[5-7]。IHNV主要危害鲑鳟鱼类的鱼苗及幼鱼，导致鱼苗死亡率极高，可达100%[5-6]。我国近几年冷水鱼养殖业发展迅速，因而需警惕IHNV威胁，及时做好防控，防止其对冷水鱼养殖产业造成严重危害。

IHN可通过临床和病理诊断进行初步判断，对其确诊则需进一步的实验室检测。目前检测IHNV的方法主要有病毒分离培养、抗体中和试验、免疫组化法、ELISA以及RT-PCR等[7-9]。这些方法一般费时费力，且对试验平台要求很高，需要一些专业设备。逆转录环介导等温扩增技术（reverse transcription loop-mediated isothermal amplification，RT-LAMP）具有操作简便、快速、特异性强等优点，不需很专业的仪器设备，仅在水浴锅中即可完成扩增，特别适用于基层及现场快速诊断[10]。本研究针对IHNV糖蛋白基因的特定区域设计3对特异性引物，并在反转录酶和BstDNA聚合酶作用下，对靶序列进行等温核酸扩增反应，建立了简单、快速、灵敏度高、特异性好的IHNV检测方法，从而丰富了实验室和现场检测IHNV的手段。

1 材料与方法

1.1 毒株

IHNV BJSY株（GenBank登 录 号MH374162）：由本实验室分离保存；鲤春病毒血症病毒（spring viraemia of carpvirus，SVCV）、牙鲆弹状病毒（hirame rhabdovirus virus，HRV）灭活病毒：购自美国菌种保藏中心；病毒性出血性败血症病毒（viral haemorrhagic septicaemia virus，VHSV）灭活病毒：购自中国典型培养物保藏中心。

1.2 RT-LAMP 引物设计与合成

对GenBank 收录的多条IHNVG基因序列进行比对，选取IHNV特异性保守区段，利用在线软件 Primer Explorer V5（http://primerexplorer.jp/e/），针对G基因保守区设计3对RT-LAMP专用引物，序列见表1，引物由华大基因公司合成。将引物均稀释为20 pmol/μL，-20 ℃保存备用。

表1 G基因RT-LAMP 引物序列

1.3 病毒RNA 提取

取200 μL 病毒液于无RNA 酶的离心管中，用Star Spin病毒RNA提取试剂盒（北京康润诚业生物科技有限公司）提取病毒RNA，分装，使用A one 超微量全光谱分光光度计（北京同立创辉仪器有限公司），测定提取到的病毒样品RNA 浓度，用DEPC 处理水稀释RNA样品为50 μg/mL，置

-80 ℃保存备用。

1.4 RT-LAMP 检测方法建立及优化

建立25 μL的RT-LAMP 扩增反应体系，体系包含对应于G基因的6 条引物：F3-G与B3-G各0.5 μL，FIP-G与BIP-G各2 μL，LF-G与LB-G各1 μL，dNTP（10 nmol/L）2.5 μL，10×ThermoPol反 应 缓 冲 液 [20 mmol/L Tris-HCl、10 mmol/L KCl、10 mmol/L (NH4)2SO4、2 mmol/L MgSO4、0.1% Triton X-100]2.5 μL，以及 8 UBst2.0 DNA聚合酶（NEB公司），10 U AMV 反转录酶（诺唯赞生物科技有限公司），1 μL IHNV的RNA样品（50 μg/mL），用无RNA 酶水补齐至 25 μL，混匀。同样的体系设立5个样品，分别编号1～5。将5个样品分别在61、62、63、64、65 ℃恒温水浴锅内反应40 min，随后都转移至80 ℃水浴2 min用以灭活BstDNA 聚合酶。反应结束后，将扩增产物各加入1 μL 50 倍稀释的SYBR Green I，轻轻震荡，直接观察反应液颜色变化，判断结果。取4 μL产物用1.5%琼脂糖进行凝胶电泳，观察结果，确定最佳反应温度。

1.5 RT-LAMP 特异性试验

分别取IHNV、SVCV、HRV 和VHSV基因组RNA（50 μg/mL）各1 μL为模板，构建RT-LAMP体系，利用建立的RT-LAMP 检测方法进行特异性对比试验，同时以去离子水为模板，相同体系和条件反应作为阴性对照。将扩增结束后产物加入1 μL 50倍稀释的SYBR Green I，轻轻震荡，直接观察反应液颜色变化，并利用1.5%琼脂糖凝胶电泳，对比检测结果。

1.6 RT-LAMP 灵敏性试验

将提取的IHNV RNA（50 μg/mL）作10 倍梯度稀释（5.0×100～5.0×10-5μg/mL），每个稀释度各取1 μL构建RT-LAMP体系，采用优化过的条件进行灵敏性试验。将扩增产物加入1 μL 50 倍稀释的SYBR Green I，轻轻震荡，直接观察反应液颜色变化，并利用1.5%琼脂糖凝胶电泳，对比检测结果，得出该方法能检测IHNV核酸的最低浓度。

1.7 重复性试验

利用建立的RT-LAMP 检测方法，在不同时间，对同一阳性IHNV的RNA样品进行检测，同时设立阴性对照，以验证本方法的稳定性。

1.8 RT-LAMP临床检测

从河北省多个养殖场采集疑似患IHN的虹鳟鱼幼鱼（体质量15 g左右），挑选10条，采集肝组织，分别用Star Spin病毒RNA提取试剂盒提取RNA，编号分别为1～10。各取1～10号RNA样品1 μL，利用本试验建立的IHNV RTLAMP 进行检测，并利用1.5%琼脂糖凝胶电泳验证检测结果；同时对1～10号RNA样品，利用之前已经建立的IHNV RT-PCR方法进行检测[11]。先用反转录试剂盒将提取的RNA进行反转录，然后以反转录产物为模板，上游引物为5'-CACCGTACTTTGCTGCTAC-3'，下游引物为5'-TCAAGGGGGGAGTCCTCGA-3'，目的片段为786 bp，进行PCR扩增。PCR 程序为：94 ℃ 预变性5 min；94 ℃ 30 s，55 ℃ 30 s，72 ℃ 25 s，25 个循环；72 ℃再延伸5 min，然后将扩增产物用1%琼脂糖凝胶进行电泳。观察结果，对比分析该方法在临床检测上的适用性。

2 结果与分析

2.1 RT-LAMP 反应温度优化

将5组 25 μL 反应体系分别在 61、63、65、67、69 ℃恒温水浴锅内反应40 min，随后转移至80 ℃水浴2 min；各加入1 μL 50 倍稀释的SYBR Green I，混匀，观察颜色变化。结果显示：当扩增温度为61、63、69 ℃时，扩增产物加入SYBR Green I 后仍为SYBR Green I的原始颜色红棕色（图1-A），电泳没有出现阶梯状电泳条带（图1-B）；在65、67 ℃时，扩增产物加入SYBR Green I后变为荧光绿色（图1-A），电泳出现阶梯状电泳条带（图1-B）。该显色结果与凝胶电泳结果相符，3次重复试验的结果也一致，表明该方法在温度为65、67 ℃时可以有效扩增，67 ℃时颜色变化更显著，条带更亮，所以本试验将67 ℃作为该方法的最佳扩增温度。

图1 RT-LAMP反应条件优化结果

2.2 RT-LAMP 特异性试验

IHNV、SVCV、HRV和VHSV基因组结构相似，同属水生动物弹状病毒，感染鱼类后的临床症状也基本相似不易区分；采用RT-LAMP方法进行检测，也容易受相似核酸模板和一些污染物干扰，导致出现假阳性扩增。因此，本试验利用SVCV、HRV、VHSV和ddH2O作对照，检测该RT-LAMP方法的特异性。结果显示：以IHNV RNA为模板进行RT-LAMP 扩增后，产物加入SYBR Green I，混匀后变为荧光绿色（图2-A），凝胶结果呈特异性阶梯状条带（图2-B）；以SVCV、HRV、VHSV和ddH2O为模板，按相同体系和条件进行RT-LAMP 检测，发现产物呈红棕色（图2-A），凝胶电泳无特异性阶梯状条带出现，结果为阴性（图2-B）；进行3次重复试验，发现结果一致。上述结果说明，本试验建立的RT-LAMP 检测方法具有良好的特异性。

图2 RT-LAMP 特异性检测结果

2.3 RT-LAMP灵敏性试验

分 别 以 5.0×10-3、5.0×10-4、5.0×10-5、5.0×10-6、5.0×10-7、5.0×10-8μg 的 IHNV RNA 为模板，利用建立的RT-LAMP 检测方法，分析该检测方法的灵敏性。观察扩增产物加入SYBR Green I后的颜色变化，取4 μL经1.5%琼脂糖凝胶电泳，观察验证可视化检测结果。结果显示：当病毒RNA为 5.0×10-3～5.0×10-7μg 时进行 RT-LAMP 反应，产物在加入SYBR Green I 后变成荧光绿色（图3-A），电泳特异性阶梯状条带（图3-B）；当病毒RNA为5.0 ×10-8μg时，产物加入SYBR Green I后颜色不变，仍为红棕色（图3-A），电泳也无特异性阶梯状条带（图3-B）；进行3次重复试验，结果一致。上述结果说明，本试验建立的RTLAMP 检测方法具有较高的灵敏度，最低可检测5.0×10-7μg 的 IHNV RNA。

图3 RT-LAMP 灵敏性检测结果

2.4 重复性试验

经过3次重复性试验，IHNV的RNA样品均能检出阳性，而阴性对照无扩增，结果一致，证明本试验所建立的RT-LAMP检测方法具有良好的重复性和稳定性。

2.5 RT-LAMP 临床应用检测

将提取的10个临床样品RNA，利用本试验建立的IHNV RT-LAMP 方法进行检测，同时利用之前已建立的RT-PCR方法进行对比检测，结果发现1号、4号和5号样品呈现荧光绿色，样品中检出IHNV，其余7个样品呈红棕色，未检出IHNV（图4-A）；琼脂糖凝胶电泳结果显示，1号、4号和5样品出现电泳特异性阶梯状条带，为IHNV阳性，其余7个样品为阴性（图4-B）。该试验结果与之前建立的RT-PCR方法检测结果一致，1号、4号和5样品出现786 bp的目的条带，为阳性（图4-C），证明RT-LAMP可应用临床检测。

图4 临床样品检测结果

3 讨论

IHNV是水产养殖业中最严重的病毒性病原之一，感染的鱼类主要为冷水鱼，如虹鳟、河鳟、太平洋鲱、大西洋鲑、各类大麻哈鱼和管吻刺鱼等[12-13]。最早报道的IHNV基因型为U、M、L，主要分布在北美；欧洲流行的毒株主要为基因E型，亚洲的日本、韩国、中国（包括台湾）流行的毒株主要为JRt型[14-15]。IHNV对鱼苗致死率极高，一旦引发疫情，难以控制。如果IHNV在我国冷水鱼养殖地区长期流行，势必会蔓延发展，造成严重危害。为保障相关经济鱼类养殖和珍稀鱼类保护工作，需要警惕IHN暴发，采用先进方法快速确定病原，及时做好防控。

近年来，环介导等温扩增技术（LAMP）操作简单、结果相对可靠，逐步被广泛应用于病原体检测。国内外已建立了多种病毒的LAMP检测方法[11，15]。本试验建立的IHNV RT-LAMP检测方法，可以一步完成反转录和环介导等温扩增，降低了中间过程造成的污染风险。该方法针对该病毒G基因保守片段设计了3对引物，特异性好，避免了相似弹状病毒的干扰，又能准确检出病毒。该方法利用荧光染料直接染色，通过染料颜色的变化或者凝胶电泳方法就可直接观察结果，易于判断。

浊度分析仪也可以通过检测LAMP的焦磷酸盐沉淀来判定LAMP检测结果，但在实际中发现，该方法的检测灵敏度较差，不如荧光染料法和电泳法。LAMP方法简单快捷，具有很多优点，适用于基层及现场快速诊断，但由于LAMP方法扩增非常高效，容易在空气中形成核酸片段的气溶胶污染，在封闭环境下，长期检测同类样品时容易出现假阳性，因此需要特别注意，防止管内的核酸片段扩散到封闭环境的空气中。如果需要封闭环境，长期检测同类样品，可以在反应前将稀释的SYBR Green I小心加到装有样品的PCR管盖上，待反应结束后，不开盖，直接离心，使SYBR Green I落入管底，漩涡震荡混匀后即可观察颜色变化，这样可防止开盖引起的气溶胶污染，避免假阳性出现。

4 结论

本研究建立的IHNV RT-LAMP检测方法，具有操作简便、快速、灵敏度高等优点，不需很专业的仪器设备，仅在水浴锅中即可完成扩增，适用于基层及现场快速诊断。该方法的建立丰富了实验室和现场检测IHNV的手段，对IHN的快速诊断及防控具有重要意义。