新疆一起驴腺疫的诊断与治疗

苏战强，孙 雪，翟少华，张 毅，佟盼盼，阿不力米提·沙吾提

（新疆农业大学动物医学学院，新疆乌鲁木齐 830052）

马腺疫（equine strangles）俗称喷喉，中兽医称槽结、喉骨胀，是由C群链球菌中的马链球马亚种（Streptococcus equisubsp）引起的一种马属动物急性热性、高度接触性传染病，所有马属动物对其都易感，但马最易感，骡和驴次之，尤以1～2岁马多发[1]。Jorda-nus Ruffus 1251年报道了马链球菌引起的马疾病，通常称为腺疫（strangles）。2017年前，腺疫是包括美国在内许多国家最常报道的马属动物疫病[2]。在我国，马腺疫一年四季均会发生，呈散发性或地方性流行[3]。新疆是全国养马数量最多的地区，有些地区的马腺疫发病率高达80%～90%。王彩蝶等[4]报道，新疆昭苏县、特克斯县、富蕴县、吉木乃县的马养殖区均有不同程度的马腺疫链球菌感染。但马链球菌导致驴发病的报道较少。本次疫情发生在新疆和田地区一驴养殖场。2018年该场陆续从山东省、河南省引进关中驴和德种驴2种肉用驴（平均体质量200～350 kg），3月份引进公驴700头，至6月该养殖场饲养规模已达8 000头，5月中旬暴发疫病后，日死亡数量达20余头，5月底病死驴已有500余头，病因不详，为此进行了实验室诊断。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 病料 无菌收集病死驴肺脏、肝脏、脾脏、肾脏和心血样本。

1.1.2 材料及试剂 材料：洁净的剪刀、镊子、托盘、酒精灯、无菌试管、接种环、载玻片、培养皿等。主要试剂：革兰氏染色液、脑心浸出液肉汤（Brain Heart Infusion Broth BHI）、Mueller-Hinton琼脂（MH）、LB固体培养基，购自北京鼎国昌盛生物技术有限责任公司；2×Taq PCR Green Mix、ddH2O、16SrDNA通用引物等，购自天根生化科技（北京）有限公司；细菌微量生化鉴定管、法国科玛嘉尿路菌群显色培养基，购自青岛高科技工业园海博生物技术有限公司；5%绵羊血平板，自制。主要仪器：自动高压灭菌器（HVE-50）、离心机（Eppendorf AG 22331 Hamburg）、空气浴振荡培养箱（ST-F160AC）、SW-CJ-2F双人双面垂直洁净工作台，为上海博讯实业有限公司医疗设备厂产品；TProfes-sional PCR 仪，为Biometra公司产品；凝胶成像系统，为UniversalHoodll Bio-Rad公司产品。

1.2 方法

1.2.1 临诊诊断 观察发病驴体温、心跳、呼吸、可视黏膜、营养状况等，结合问诊进行初步诊断。

1.2.2 剖检诊断 剖检病死驴，观察并记录脏器的结构、大小、颜色，检查有无出血等病理变化。

1.2.3 样本触片镜检 用镊子夹取样品内部中心处组织，擦拭在载玻片上，按革兰氏染色液使用方法进行染色，用油镜观察。

1.2.4 药敏试验 本次药敏试验选择10类共计30种药敏片。蘸取适量菌液，用涂布棒均匀涂布于MH培养基后，贴上药敏片。1个培养皿贴4～5片药敏片为宜，放置好后37 ℃恒温培养8～12 h，测量抑菌圈大小。

1.2.5 细菌分离纯化 在超净台内，用接种环蘸取菌液，以“Z”字形状接种于5%绵羊鲜血平板、法国科玛嘉尿路菌群显色培养基，37 ℃恒温培养12～24 h，选取优势可疑菌进行纯化培养并革兰氏染色、镜检。

1.2.6 细菌16S鉴定 可疑菌落纯化培养3代后，挑取单菌于BHI增菌培养，提取菌液DNA模板，参考细菌16SrDNA 通用引物（27F：AGAGTTTGATCCTGGCTCAG；1492R：CGGTTACCTTGTTACGACTTC）扩增片段，比对确定可疑菌种属。PCR常规体系反应程序：预变性94 ℃ 5 m；变性94 ℃ 30 s，退火54 ℃ 30 s，延伸72 ℃ 1.5 min，35个循环；延伸72 ℃ 10 min。扩增产物于1%琼脂糖凝胶在20×TAE电泳液中电泳30 min，EB浸泡15 min，在凝胶成像系统中记录结果。将清晰明亮条带对应的PCR产物，送鼎国生物工程技术服务有限公司测序，所得序列在BLAST上进行同源性比对。

1.2.7 生化试验 纯培养可疑菌落，挑取同一平皿单菌于细菌微量生化鉴定管中37 ℃培养12～36 h，按说明书判读，将结果与第8版《伯杰细菌鉴定手册》[5]比对。

2 结果

2.1 临诊症状

发病驴多消瘦，体温升高（40～43℃），呼吸急促或困难，多为腹式呼吸，精神沉郁，食欲不振，渴欲增加；随着病情发展，病驴陆续出现死亡，个别病驴鼻孔流出灰黄色分泌物（图1），大部分驴被毛杂乱无光泽、消廋（图2）。

图1 发病驴鼻孔分泌灰黄色分泌物

图2 病死驴消瘦、被毛杂乱

2.2 病理剖检

消化系统：小肠肠管显著充血、出血；肠系膜出血，血管扩张、充血；结肠管腔显著扩张，肠壁紧张性增强，部分肠段淤血，肠道浆膜破裂，内容物溢出；脾脏淤血、肿胀，表面有广泛性灰白色粟粒大、结节状增生（图3）；

呼吸系统：支气管黏膜充血，肺脏体积增大，表面颜色变浅，有肋骨压痕，出血、充血扩张，肺脏切面流出大量如酱油样暗黑色液体（图4）。

其他脏器：肾脏颜色暗红、淤血、肿胀，肾髓质部增宽，突出于肾脏内侧，皮质部变窄，局部肾组织皮质与髓质界限不清（图5）；肝脏色泽变浅，呈土黄色外观，体积显著增大，质地变脆，边缘淤血，呈暗红色（图6）。

图3 病变脾脏

图4 病变肺脏

图5 病变肾脏

图6 病变肝脏

2.3 样本触片镜检

将样本直接触片进行革兰氏染色、镜检，发现着色不明显，可见球型单菌（图7）。

图7 肺脏样本触片镜检结果（oil×100）

2.4 药敏试验

药敏结果（表1）显示，样本对β-内酰胺类药物较敏感。

表1 药敏试验结果 单位：mm

2.5 细菌分离培养

通过接种绵羊血平板和法国科玛嘉培养基，发现样本中仅有一种β溶血革兰氏阳性球菌，溶血环直径可达2 mm（图8），且镜检形态与原始样本触片菌一致（图9）。

2.6 细菌16SrDNA PCR鉴定

收集纯菌落进行16SrDNA PCR检测，发现在1 500 bp处出现明亮条带；将测序结果在BLAST上进行同源性比较，发现与马链球菌马亚种和马链球马兽疫亚种同源性均达99%（图10）。

2.7 生化鉴定

将生化指标（表2）与《伯杰氏手册》进行比对，发现该菌更符合马链球菌，而不是兽疫链球菌。经过触片镜检、菌株培养特点、16S测序、生化鉴定等试验，证明样本内的分离株为马链球菌马亚种。

图8 样本β溶血

图9 革兰氏阳性球型单菌镜检形态（oil×100）

3 治疗

根据药敏试验结果，快速反馈当地兽医，选择头孢噻肟等药物进行治疗，1周后驴场疫情得到控制。

4 讨论

马腺疫是由马链球菌马亚种引起马、骡、驴的一种急性传染病，临诊以发热、呼吸道黏膜发炎、颌下淋巴结肿胀化脓、持续性单侧或双侧流黏浓性鼻液为主要特征，这也是临床马腺疫的诊断要点[6]。由马链球菌马亚种引起的驴腺疫早有报道。1998年张八军[7]报道了甘肃省一起驴腺疫疫情，发病驴有体温升高、呼吸困难、淋巴结轻度肿胀，严重者淋巴结破溃流出脓液后体温下降等临诊症状，与马发生腺疫的临诊症状并无明显差异。2002年也有报道，皮山县驴场出现相似临诊症状的驴腺疫病例[8]，患病驴出现体温升高、心跳加快、呼吸困难、食欲废绝和分泌黏浓性鼻液为主的临诊特征，但是未出现淋巴结肿大和溃烂等症状。淋巴结病变不明显是该病诊断的难点。

图10 16SrDNA PCR鉴定结果

表2 生化鉴定结果

剖检该驴场病死驴，发现肺脏充血、出血，剖开肺脏发现流出暗红色液体，肺脏病变较其他脏器更为严重。有报道[9]称，马链球马亚种在影响肺功能方面起主要作用，会对畜牧业造成巨大经济损失。剖检多有胃破裂现象。结合呼吸困难、心跳加快等临诊症状并结合剖检诊断中肺脏功能减退的病理变化，认为引起胃破裂的原因可能是发病驴呼吸困难，继而衰竭时极度挣扎造成的。

将分离株测序结果在BLAST上比对后发现，该菌与马链球马亚种和马链球兽疫亚种的同源性均达到了99%，无法区分。这时生化指标就显得尤为重要。参考马链球菌马亚种不能发酵山梨醇的特点[5]，最终确诊该驴场病原菌为马链球菌马亚种。

合理的规划养殖和洁净的引进来源是疫病防控的基础。此次驴场发病与不合理的养殖规划有不可分割的关系。现场调查发现，规划的隔离观察新引进驴只的预备圈舍面积与引进驴只数量差距较大。规划每圈舍养殖不超过180头，但实际每圈养殖密度高达200～500头。密集养殖使该驴场出现了营养不均的问题，表现为弱小驴抢不到饲料、发育迟缓等。长途运输、拥挤、焦躁以及气温和环境的变化，使这些弱小驴首当其冲，从而使马腺疫成为隐患。此次疫情确诊后，该驴场计划接种相应的疫苗，同时结合降低养殖密度、周围环境消毒以及药物治疗等措施，逐步根除和净化该病。该疫情也提示，该地区应重视马腺疫的危害，普及相关知识，做到早预防、早发现和早治疗。