真核生物基因定位的实验探索（2）

王 海 荆永涛

（河南省周口市第一高级中学 河南周口 466000）

（上接2019年第8 期第44 页）

3 现代基因定位——细胞与分子水平的基因定位

3.1 利用非整倍体进行基因定位

3.1.1 单体定位法 用于将某特定基因定位于某条常染色体上。原理：利用假显性现象，即由于不存在显性基因而使隐性基因得以表现的现象。在单体不致死且能产生可育配子的情况下，对某号染色体缺失1 条的单体显性纯合体测交，若子代出现显性∶隐性=l∶l 的分离比，则基因位于该号染色体上。

任务6：动物中缺失1 条染色体的个体叫单体（2n－1）。大多数动物的单体不能存活，但在黑腹果蝇（2n＝8）中，Ⅳ号染色体（点状染色体）缺失1条也可以存活，且能繁殖后代，可用于进行遗传学研究。该果蝇种群中存在正常肢（DD）和短肢（dd）个体，已知短肢基因位于常染色体上，现有多种正常果蝇和Ⅳ号单体果蝇，请设计实验以判断短肢基因是否位于Ⅳ号染色体上。写出实验思路和对结果的预测与结论。

问题引领：若让非单体的短肢果蝇个体与正常肢（纯合）Ⅳ号染色体单体果蝇交配，子代表型如何？

思路点拨：遗传图解如下：

图7 果蝇单体定位法

实验结果预测及结论：若子代中出现正常肢果蝇和短肢果蝇，且比例为1∶1，则说明短肢基因位于Ⅳ号染色体上；若子代全为正常肢，则说明短肢基因不位于Ⅳ号染色体上。

3.1.2 三体定位法 在三体不致死且能产生可育配子的情况下，F1中三体自交后代的分离比为35∶1（非3∶1），测交后代分离比为5∶1（非1∶1）。

任务7：已知玉米（2n=20）种皮有色A 对无色a 为显性，籽粒饱满S 对凹陷s 为显性。现有一系列的纯合体正常玉米、可育三体玉米、可育单体玉米、突变体无色玉米和突变体凹陷玉米的种子，请设计实验探究等位基因A、a 和S、s 在染色体上的位置。

图8 三体定位法原理

图9 玉米三体基因定位法

利用单体和三体，都可将基因A 定位在玉米Ⅲ号染色体上。只要具备相应于每一染色体的一系列三体或单体品系，便能从杂交子代的突变型和野生型的比例中判断任何一个突变基因所属的染色体。小麦是多倍体植物，多倍体植物增加或减少1 条染色体不会使其生活力受到严重影响，因此容易建立整套三体或单体品系，使基因定位工作得以顺利进行。除了小麦等植物以外，该方法也用在酵母菌的遗传学研究中。

3.2 细胞水平的基因定位

3.2.1 体细胞杂交法基因定位探究情境：体细胞杂交法

1）体细胞杂交的概念：也称细胞融合（cell infusion），是将来源不同的2 种细胞融合成1 个新细胞。新产生的细胞称为杂种细胞（hybrid cell），含不同种双亲的染色体。

2）对象：人的细胞与鼠类细胞（大鼠、小鼠、仓鼠）。

3）杂种细胞的特点：在繁殖传代过程中，人的染色体优先丢失，以至最后只剩几条或1 条人的染色体，而啮齿类的染色体被保留下来。

人-鼠杂种细胞内含有完整的小鼠染色体组和1～7 条不等的人染色体，且所含的人染色体类型也不完全相同，因此这种杂种细胞是进行连锁分析和基因定位的极好材料。

通过检验不同的杂种细胞系，将某一标记基因存在与否，与每一细胞中人的某一染色体的存在与否相联系，即可推知某一基因是否在某号染色体上。通过分析某基因产物与某条人类染色体是否共同存在即可进行基因定位。Miller 等运用体细胞杂交并结合杂种细胞的特征，证明杂种细胞的存活需要胸苷激酶（TK）。含有人17 号染色体的杂种细胞都因有TK 活性而存活，反之则死亡，从而推断TK 基因定位于17 号染色体上，这是首例应用体细胞杂交法进行的基因定位。

肽酶C（peptidase C）是小鼠中没有的，而人类可以产生此酶，若在杂种细胞系中除小鼠的全套染色体组外还留有一条人类1 号染色体，同时又测得肽酶C 的活性，即可推断肽酶C 基因位于人类的1 号染色体上。

任务8：测定杂种细胞中标记基因与染色体之间的对应关系如表2，确定基因a、b、c、d 在人染色体1、2、3 上的位置。

表2 标记基因与染色体之间的对应关系

思路点拨：甲、乙、丙、丁、戊5 个“人-鼠”融合细胞株，它们分别保留有人染色体1、2、3 中的某一个或几个，例如细胞株甲保留染色体2，细胞株丁保留1、2、3 这3 个染色体等。分别测定a、b、c、d 4 种表型，例如某种酶的活性或某种抗原的存在与否等。已经知道这些特性都是小鼠细胞所没有的，从表中的结果可以看到，任何1 个细胞株只要测得（或不能测得）a 这一性状时必然同时可以测得（或不能测得）c 这一性状。通过类比推理，这一结果说明这2 种酶或抗原蛋白的基因位于同一染色体。其次可以看到任何1 个细胞株凡是保留染色体2 的必然出现上述性状，可见上述2 个基因都在人的2 号染色体上。

3.2.2 缺失法基因定位

原理：根据某一性状与染色体的结构变化确定。例如人类的猫叫综合症，出生的婴儿为满月型脸，眼间距宽，哭声似猫叫。细胞学检查为5 号染色体短臂缺失，因此，相关基因可定位于5 号染色体上。

3.2.3 性状与性别联系法基因定位

原理：性状与性别紧密相连，说明基因在性染色体上。有的性状（例如耳毛）仅仅在男性出现，则基因位于Y 染色体上；有的性状在男、女中都有，但男多女少（例如色盲基因），则基因位于X染色体上；有的性状在男、女中比例均等，则基因位于常染色体上。

3.2.4 基因剂量效应法基因定位

原理：有的基因多1 份就会多表达1 份。人类的过氧化物歧化酶Ⅰ基因，人类的21 三体中，此酶活性为正常个体的1.5 倍，即此基因位于21 号染色体上。人的红细胞酸性磷酸酶Ⅰ基因，当2 号染色体短臂缺失时此酶活性下降一倍，即此酶基因位于2 号染色体上。

3.2.5 单元化定位法基因定位 在构巢曲霉这一类真菌的准性生殖过程中，杂合二倍体细胞在有丝分裂时常随机地丢失染色体。染色体在多次有丝分裂过程中逐条丢失而使二倍体细胞最终转变为单倍体细胞的过程称为单元化。如果1 对染色体中带有显性的野生型基因的染色体丢失了，则同源染色体上隐性基因的性状便得以表现。

问题引领：表型除了受基因型控制外，还会受到环境因素的影响。仅通过观察杂交后代性状分离比进行基因定位，并非十分可靠。能否利用分子生物学技术直接在染色体上对基因进行精准定位？

3.3 分子水平的基因定位

3.3.1 原位杂交和荧光原位杂交

思路点拨：可否用分子标记DNA 探针，与变性后的染色体或细胞核靶DNA 杂交，在荧光显微镜下直接观察并记录结果。

原位杂交：是最直接的基因定位方法之一，是分子生物学技术在基因定位中的应用。

原理：碱基互补配对。用放射性或非放射性物质标记的DNA、RNA 或与mRNA 互补的cDNA 作探针，可检测细胞基因组中的同源部分。

原位杂交的特点：杂交在载玻片上的中期染色体上进行，而不是在溶液和膜上进行。原位是指在标本上DNA 原位变性，再与放射性或非放射性物质（通常用3H）标记的已知核酸探针杂交，通过放射自显影来检测染色体上特异DNA 顺序，用放射性颗粒在某条染色体的区带出现的最高频率或荧光的强度确定探针的位置，从而准确地进行基因定位。

图10 原位杂交的步骤

荧光原位杂交：用特殊荧光素标记探针DNA或RNA，变性成单链后，与变性后的染色体或细胞核靶DNA 杂交。在荧光显微镜下观察并记录结果。

这种方式快速简捷，但杂交信号较弱，且不能进一步放大；为了使杂交信号足够强，可以进行信号扩增。扩增的方法是加上一层荧光标记的标记分子的抗体，再加上一层偶联了标记分子的抗－抗体，然后再加一层荧光标记的标记分子的抗体，形成三明治结构。以生物素标记为例，在加荧光标记的抗生物素蛋白avidin 之后，加一层山羊生物素标记抗－抗生物素D，然后再加一层荧光标记的抗生物素蛋白。

图11 荧光原位杂交原理

图12 荧光原位杂交法将基因定位在某号染色体上

3.3.2 电泳与DNA 分子杂交

探究情境：图13是甲、乙2 种遗传病的系谱图。已知这2 对等位基因分别位于2 对同源染色体上。经DNA 分子结构分析发现，突变基因（乙病基因）与其等位基因（正常基因）相比，突变后致某限制酶的切割位点缺失。图14表示甲、乙、丙3人控制乙种病的等位基因核酸分子杂交诊断结果示意图。对Ⅱ3和Ⅲ13进行核酸分子杂交诊断发现，Ⅱ3电泳结果与右图中甲相同，Ⅲ13电泳结果与右图中乙相同。

图13 2 种遗传病的系谱图

图14 核酸分子杂交诊断结果

任务9：判断控制甲、乙2 种病的遗传方式（即等位基因的位置）。

思路点拨：从图13中的Ⅱ7、Ⅱ8和Ⅲ11可以看出甲病为常染色体上的显性遗传病，从Ⅱ3、Ⅱ4和Ⅲ10只能看出乙病为隐性遗传病，但无法判断基因的位置。借助于电泳与DNA 分子杂交技术能作进一步的判断。

图15 凝胶电泳

图16 电泳结果解析

思路点拨：DNA 分子带负电荷，在电泳液中通电后向阳极迁移，且DNA 分子的结构相同所带电荷量相同；线性DNA 分子迁移的速率主要与其大小有关，分子越小迁移率越快。所以电泳图谱上条带3 为突变基因，1、2 为酶切后的正常基因。甲体细胞中含有B 和b2 个基因，乙只有正常基因，丙为患者，只具有突变基因。Ⅱ3（男性）的电泳结果与甲相同，因为首先乙病不是单纯伴Y 遗传，若基因位于X 上，正常男性体细胞中只能有基因B 或b 中的一个，显然Ⅱ3具有B、b2 个基因，说明基因位于常染色体上。

3.3.3 克隆基因定位法

思路点拨：用显微镜可以观察到染色体，但无法看到基因。为了定位人体白蛋白基因，首先以人体白蛋白基因cDNA 为探针，分别与经HindⅢ酶切后的人体细胞和中国仓鼠卵巢细胞（CHO）DNA杂交，杂交后的人体细胞DNA 显示6.8 kb 带型，CHO 细胞的DNA 显示3.5 kb 带型。进一步分别用HindⅢ酶切各种人-CHO 杂种细胞系的DNA，再与白蛋白基因cDNA 探针杂交，如果出现6.8 kb和3.5 kb 带型者称为阳性杂种细胞，而只显示3.5 kb 带型者为阴性细胞。由于人体白蛋白基因的cDNA 探针的特异性，6.8 kb 带型的杂交带只出现在含有人体4 号染色体的杂种细胞中，而在不含4 号染色体的杂种细胞中均不出现，因此可将白蛋白基因定位在4 号染色体上。

图17 克隆基因定位法

通过对遗传家系（种群）、细胞、分子3 个层面上的基因定位的探究学习，沿着科学家的足迹由浅入深地前进，在思维层面经历探究的过程，体现“让学生领悟科学家在研究过程中所持有的观点以及解决问题的思路和方法”“学生在亲历提出问题、获取信息、寻找证据、检验假设、发现规律等过程中习得生物学知识，养成科学思维的习惯，形成积极的科学态度，发展终身学习及创新实践能力”的课程性质。落实“让学生积极参与动手和动脑的活动，通过探究性学习活动或完成工程学任务，加深对生物学概念的理解，提升应用知识的能力，培养创新精神”的课程理念。努力达成“掌握科学探究的思路和方法”的课程目标，促进学生掌握本学科关键能力，培养创新型人才。