p97抑制剂NMS-873对Eca109细胞增殖、凋亡及迁移能力的影响

张璐玉，崔艳艳，王文杰，张彦婷，刘艳霞，马珊珊，刘红涛，张 乐，刘腾飞，周建康，王亚苹，关方霞

郑州大学生命科学学院 郑州 450001

食管鳞状细胞癌(食管鳞癌)是我国常见的消化系统肿瘤，患者生存期短，预后差[1]。研究[2]表明，与正常细胞相比，癌细胞更依赖于蛋白质质量控制系统，以维持蛋白质稳态平衡；打破癌细胞内蛋白质稳态平衡已成为肿瘤治疗的新方向。p97蛋白，又称含缬酪肽蛋白，作为AAA+ATP酶家族的一员在细胞中广泛存在，参与了多种重要的细胞生物学过程，包括蛋白质稳态调控、自噬、染色质重塑、转录活性调节、免疫信号传导等[3-5]。p97蛋白作为泛素-蛋白酶体系统(ubiquitin-proteasome system，UPS)的重要组分，在蛋白质稳态调控中发挥关键作用[4]。研究[6-8]表明，p97在多种肿瘤细胞中高表达，抑制p97活性能够在体内外水平抑制非小细胞肺癌、结直肠癌、浆细胞癌等多种肿瘤细胞的增殖。然而，目前尚未见到p97与食管鳞癌的相关研究。因此，本研究观察了p97抑制剂NMS-873[9]对食管鳞癌Eca109细胞增殖、凋亡及迁移的影响，旨在从细胞水平探讨p97与食管鳞癌细胞生物学行为的关系。

1 材料与方法

1.1主要材料Eca109细胞株为实验室前期冻存，NMS-873购自美国Selleck公司，CCK-8检测试剂盒购自日本同仁公司，EdU细胞增殖检测试剂盒购自中国广州锐博生物公司，DMSO购自美国Sigma公司，AnnexinV-FITC/PI 双染细胞凋亡检测试剂盒购自江苏凯基生物公司，DMEM培养基购自HyClone公司,磷酸盐缓冲液、胎牛血清(FBS)购自以色列BI公司，胰蛋白酶消化液购自碧云天公司，Transwell小室购自美国Corning公司。NMS-873用DMSO配制成5 mmol/L的母液备用。

1.2细胞培养Eca109细胞用含体积分数10%FBS的DMEM/高糖培养基于体积分数5%CO2、37 ℃恒温培养箱中培养，每2 d传代一次。取对数生长期的细胞用于后续实验。

1.3CCK-8法检测细胞增殖按每孔4 000个细胞将Eca109细胞接种到96孔板，贴壁12 h后实验组分别加入0.1、0.5、1.0、2.0、5.0 μmol/L的NMS-873，以加DMSO为阴性对照，以不加细胞的完全培养基为空白对照，每组设3个平行孔。作用24、48、72 h后每孔加入10 μL CCK-8试剂，细胞培养箱孵育2 h，读取450 nm波长处的吸光度(A)，计算细胞存活率。存活率=[(A实验孔-A空白孔)/(A阴性对照孔-A空白孔)]×100%。根据结果筛选1、2、3 μmol/L的NMS-873用于后续实验。

1.4Transwell小室法检测细胞的迁移能力Eca109细胞经1、2、3 μmol/L NMS-873处理48 h后，消化离心，收集细胞，调整细胞密度为1×106个/mL，接种于装有Transwell小室的24孔板，以DMSO处理细胞为阴性对照，每组设3个平行孔;Transwell下室中加入600 μL含体积分数5%FBS的培养基；置于CO2培养箱中培养24 h;弃去小室中剩余培养基，甲醇室温固定30 min, PBS清洗小室中残留的甲醇溶液，加入10 g/L结晶紫染液室温染色10 min，PBS 清洗3遍，将多余的染料洗掉，用脱脂棉球轻轻擦拭小室上层未迁移的细胞，倒置显微镜下选取5个视野观察并拍照分析，计数穿膜细胞。

1.5AnnexinV-FITC/PI双染法检测细胞凋亡Eca109细胞经1、2、3 μmol/L NMS-873处理48 h后，吸弃培养液，加入不含EDTA的胰蛋白酶消化、离心，用PBS清洗2遍，按细胞凋亡检测试剂盒说明加入试剂，进行AnnexinV-FITC/PI染色，1 h内上流式细胞仪检测。以加DMSO的细胞为阴性对照，实验重复3次。

1.6EdU法检测细胞增殖Eca109消化离心后按每孔2×104个细胞接种于24孔板，每组设3个平行孔，以加DMSO的细胞为阴性对照，分别用1、2、3 μmol/L NMS-873处理48 h后，吸弃培养基，按照EdU细胞增殖检测试剂盒说明书加入EdU试剂，培养箱避光孵育2 h，含40 g/L多聚甲醛的PBS室温孵育30 min，2 g/L甘氨酸摇床孵育5 min,每孔加入100 μL的1×Apollo染色反应液,室温、避光、脱色，摇床孵育30 min；加入100 μL 1×Hoechst 33342反应液，避光、室温、摇床孵育30 min；弃去培养液，加入PBS，室温摇床清洗3次；于倒置荧光显微镜下选取5个视野拍照观察，并用Image J软件进行分析。

1.7统计学处理应用SPSS 21.0处理数据。应用3×5析因设计的方差分析分析不同浓度NMS-873作用不同时间对Eca109细胞存活率的影响，应用单因素方差分析比较各组细胞凋亡率、增殖率和穿膜细胞数的差异，两两比较采用LSD-t检验。检验水准α=0.05。

2 结果

2.1不同浓度NMS-873作用不同时间对Eca109细胞存活率的影响结果见表1。由表1可知，随着NMS-873浓度和作用时间的增加，Eca109细胞存活率逐渐降低；作用时间为48 h时，IC50为2.32 μmol/L，因此选择1、2、3 μmol/L NMS-873作用48 h为后续实验的条件。

表1 NMS-873对Eca109细胞存活率的影响(n=3) %

F时间=73.999,F浓度=458.166,F交互=5.915,P均<0.001

2.2NMS-873对Eca109细胞凋亡、增殖及迁移能力的影响结果见表2。由表2可知，随着NMS-873浓度的增加，Eca109细胞的凋亡率增加，增殖率降低，穿膜细胞数减少。

表2 NMS-873对Eca109细胞凋亡、增殖及迁移能力的影响

两两比较，P均<0.05

3 讨论

UPS作为胞内最重要的蛋白质降解系统，是调节蛋白质稳态的重要途径[10]。在肿瘤细胞中，UPS常常处于过度活跃的状态，以满足癌细胞对错误折叠蛋白的降解需求，从而缓解胞内蛋白质毒性压力。一旦UPS途径受阻，就会引起错误折叠蛋白在胞内的大量积累，进而导致癌细胞死亡[2]。因此，使用药物靶向阻断UPS中的关键组分，打破癌细胞内蛋白质稳态平衡，已成为肿瘤治疗的新方向[2]。

p97是ATP超家族中的一员，主要由N端、C端和两个保守的ATP结构域组成[11-13]。当细胞内错误折叠的蛋白质在内质网内堆积时，p97参与的UPS能够通过辅助降解胞内大量错误折叠蛋白，参与胞内蛋白质质量控制，保证细胞在蛋白质毒性压力下的存活[4,14]。目前已有研究[9,15]表明，p97蛋白在肿瘤的发生发展过程中起到了不可或缺的作用，抑制p97蛋白的活性，可以打破内质网内蛋白质稳态平衡，从而促进肿瘤细胞的凋亡。

NMS-873是目前为止最有效的特异性p97变构抑制剂[9]。NMS-873通过破坏p97蛋白ATP结构域的稳定性，靶向抑制p97蛋白的活性，从而影响内质网内错误折叠蛋白的降解，产生细胞内蛋白质毒性压力，促进细胞死亡[7,9]。本实验结果表明NMS-873作用于Eca109细胞后，能明显抑制细胞增殖，且具有时间和剂量依赖性。此外，随着作用浓度的增加，Eca109细胞凋亡率升高， 而细胞迁移能力受抑。

综上所述，NMS-873能有效抑制Eca109细胞增殖，促进细胞凋亡，并降低细胞迁移能力；p97有望成为食管鳞癌治疗的有效靶点。