异叶茴芹总黄酮抗氧化活性研究

赵良辉 王张英 王志新

摘    要：为研究异叶茴芹总黄酮的抗氧化活性，以异叶茴芹为原材料，以超声波辅助提取法提取总黄酮。以Vc为对照，通过羟基自由基、超氧阴离子、还原力、FRAP法测定异叶茴芹总黄酮抗氧化活性，采用分光光度法测定异叶茴芹总黄酮对亚硝酸钠的清除率，利用紫外光解法及比色法测定异叶茴芹总黄酮对亚硝胺的合成阻断率。结果表明：在羟基自由基的清除上，异叶茴芹总黄酮优于同等浓度的Vc，其他3种方法的测定结果显示，Vc的抗氧化活性优于异叶茴芹总黄酮。此外，异叶茴芹总黄酮在较低pH值、一定的浓度和时间内，能够有效地清除亚硝酸钠，在pH值为3.0时，异叶茴芹总黄酮在试验浓度范围内，能有效地抑制亚硝胺的合成。异叶茴芹总黄酮具有较强的抗氧化活性以及抑制亚硝化反应的作用。

关键词：异叶茴芹;总黄酮;抗氧化;抑制亚硝化反应

中图分类号：S567.23+9          文献标识码：A         DOI 编码：10.3969/j.issn.1006-6500.2019.07.002

Abstract： In order to determine the antioxidant activity of total flavonoids of Pimpinella diversifolia DC.， the total flavonoids were extracted by ultrasonic-assisted extraction method using Pimpinella diversifolia DC. as the raw material. The antioxidant activity of total flavonoids of Pimpinella diversifolia DC. was determined by hydroxyl radical， superoxide anion， reducing power and FRAP method with Vc as the positive control， the scavenging rate of sodium nitrite was determined for the total flavonoids of Pimpinella diversifolia DC.. Furthermore， nitrosamine synthesis inhibition rate of total flavonoids of Pimpinella diversifolia DC. was examined by UV photolysis and colorimetry. The results showed that the total flavonoids of Pimpinella diversifolia DC. were better than Vc of the same concentration on the elimination of hydroxyl free radicals. The measurement results of other three methods showed that the antioxidant activity of Vc was better than Pimpinella diversifolia DC.. In addition， the total flavonoids of Pimpinella diversifolia DC. could effectively clear sodium nitrite at low pH， certain concentration and effect time. At pH 3.0， the total flavonoids of Pimpinella diversifolia DC.could effectively inhibit the synthesis of nitrosamines within the experimental concentration range. The total flavonoids of Pimpinella diversifolia DC. had strong antioxidant activity and inhibition ability of nitrification.

Key words： Pimpinella diversifolia DC.; total flavonoids; anti-oxidation; inhibition ability of nitrification

異叶茴芹（Pimpinella diversifolia DC.）是伞形科茴芹属植物[1]，传统上常用于治疗偏头痛、蛇虫咬伤等疾病[2]。其含有糖类、皂苷、酚类、香豆素以及油性挥发物质，具有抗菌、平喘及一定的抗炎、凝血、止血作用[3-5]。

在正常生物体内，氧化与抗氧化系统处于相对稳定的动态平衡中，若失去平衡，体内氧自由基含量升高，便会引发机体产生各种病变和老化，危害身体健康[6]。黄酮类化合物因其具有良好的抗氧化活性，毒副作用小，在自然界的植物中普遍存在而引起人类的关注，其具有止咳、护肝、降低血清胆固醇、抑制肿瘤增长等作用[7-9]。此外，由于自然界中广泛存在着硝酸盐和亚硝酸盐，人体摄入后可以在体内合成亚硝胺，其具有一定的致癌作用，会使多种器官产生恶性肿瘤[10]。很多试验研究表明，黄酮类化合物还能有效的清除亚硝酸盐和阻断亚硝胺合成[11-16]。目前已有研究人员对异叶茴芹总黄酮的最佳提取方法进行了探究[17]，但没有对它的功能进一步研究。为了综合利用异叶茴芹资源，本课题对异叶茴芹总黄酮抗氧化活性及拮抗亚硝酸钠能力进行研究，为进一步挖掘异叶茴芹的药用价值提供试验及理论依据。

1 材料和方法

1.1 試验材料

异叶茴芹从福建省寿宁县购得，取地上部剪碎后用粉碎机粉碎，过直径为0.25 mm的筛。粉末在电热鼓风干燥箱中60 ℃干燥后用密封袋密封，贴标签置于干燥处备用。

1.2 试剂与仪器

36%盐酸、30%过氧化氢、焦性没食子酸、三氯乙酸、无水乙醇、硝酸铝、铁氰化钾、氢氧化钠、氯化铁、三水合醋酸钠、磷酸二氢钠、水杨酸、磷酸氢二钠、七水合硫酸亚铁、柠檬酸、亚硝酸钠、三羟甲基氨基甲烷、36%乙酸、磺胺酸、N-1-萘基乙二胺盐酸盐、抗坏血酸，此外40%二甲胺溶液、1-萘胺、三吡啶基三嗪（TPTZ）从衡阳市博生生物科技有限公司购得，以上试剂均为分析纯。

101-1AB型电热鼓风干燥箱电热鼓风干燥箱（天津市泰斯特仪器有限公司）;HH-S恒温水浴锅（国胜实验仪器厂）;JA2603B电子天平（上海精科天美科学仪器有限公司）;SB-5200D超声波清洗机（宁波新芝生物科技股份有限公司）;722SP可见分光光度计（上海棱光技术有限公司）;SW-CJ-1FD净化工作台（上海新苗医疗器械制造有限公司）;TDL-40B-II离心机（上海安亭科学仪器）;KC-100高速粉碎机（北京开创同和科技发展有限公司）等。

1.3 试验方法

1.3.1 异叶茴芹总黄酮提取及含量测定 根据文献所述，取除杂干燥后的异叶茴芹地上部粉末，用无水乙醚洗脱叶绿素，取1 g处理后的粉末用60%乙醇溶液以液料比30∶1混合，200 W超声处理40 min，离心后取上清液，放置待测[17]。用芸香叶苷作对照品建立标准曲线，平行取3次异叶茴芹提取液0.1 mL测吸光度，取平均值，计算异叶茴芹提取液总黄酮浓度及提取率。计算公式如下：

异叶茴芹总黄酮提取率=×100%（1）

式中，C为稀释后异叶茴芹总黄酮的浓度（μg·mL-1），V为提取液的体积（mL），M为处理后异叶茴芹粉末的质量（g）。

1.3.2 异叶茴芹总黄酮抗氧化活性的测定 （1）水杨酸法测定羟基自由基清除能力。将异叶茴芹总黄酮提取液稀释浓度至2.0 mg·mL-1，放置备用。分别取0.2，0.4，0.6，0.8，1.0 mL的稀释液加入相对应的试管中，用60%乙醇溶液补至1.0 mL，再按照表1所示依次添加试剂，静置7 min后，于510 nm处测量吸光度，记为Xi。另取7支试管，1支以60%乙醇代替样品稀释液测吸光度，计为X0;5支以蒸馏水代替过氧化氢溶液测吸光度，记为Xj;1支加入1.0 mL 相同浓度的硫酸亚铁溶液和水杨酸-无水乙醇溶液及2.0 mL蒸馏水，并用所得的混合溶液调零[18]。同时拿相同质量分数的Vc为对比，按此方法计算样品溶液对羟基自由基的清除能力，计算公式如下：

羟基自由基清除率=×100%                  （2）

（2）测定超氧阴离子自由基清除率。在试管中，依次加入1.0 mL不同浓度的异叶茴芹总黄酮稀释液，4.5 mL pH值为8.2的Tris-HCl缓冲液，0.5 mL 2.5 mmol·L-1的焦性没食子酸溶液，迅速摇匀后在420 nm波长处每隔0.5 min测吸光度并记录，以60%乙醇溶液调零，测定时间为4 min[14]。其他条件不变，以蒸馏水代替异叶茴芹总黄酮溶液测吸光度，计算吸光值随时间的变化率K。

将Vc用60%乙醇配制成与异叶茴芹总黄酮相同浓度梯度的溶液作为对照，试验操作同上，按照下式计算异叶茴芹总黄酮、Vc对超氧阴离子自由基的清除率。

超氧阴离子自由基清除率=×100% （3）

式中，K0为不加样液时超氧阴离子随时间的变化率，Ki为加入样液后超氧阴离子随时间的变化率。

（3）还原力的测定。将适量蒸馏水倒入250 mL烧杯中置冰箱冷藏备用，取1.0 mL不同浓度的异叶茴芹总黄酮稀释液于试管中，再依次加入2.5 mL pH值为6.6的PBS缓冲液，2.5 mL质量分数为0.1% 的铁氰化钾溶液，摇匀后置于恒温水浴锅中50 ℃水浴20 min，将试管迅速取出，放入已预冷的蒸馏水中冷却，加入1.0 mL质量分数为10%的三氯乙酸溶液，摇匀后取2.5 mL于离心管中，加入2.5 mL蒸馏水，0.5 mL质量分数为0.1%的三氯化铁溶液，混匀后静置5～6 min，4 000 r·min-1离心10 min[19]。用60%乙醇溶液调零，在700 nm波长处测吸光度，记为A，其他条件不变，以60%乙醇溶液代替样液于700 nm处测吸光度，记为A0。以Vc作对照，操作步骤同上，比较异叶茴芹总黄酮与Vc的还原力，平行做3次，计算公式如下：

还原力=A-A0 （4）

（4）FRAP法测定抗氧化活性。在试管中分别加入0.0，0.2，0.4，0.6，0.8，1.0 mL 1 mmol·L-1的硫酸亚铁溶液，再加入一定量的蒸馏水补充体积至1 mL，取4.5 mL FRAP试剂加入试管，摇匀后于37 ℃下水浴10 min，在593 nm波长处测吸光度[20]。以硫酸亚铁浓度（mmol·L-1）为横坐标，以吸光度为纵坐标绘制标准曲线。

分别取不同体积的异叶茴芹总黄酮稀释液，用60%乙醇溶液补至1 mL，其余操作如上。平行做3次，同时用60%乙醇溶解的Vc溶液作对照。样品的抗氧化性以混合溶液的吸光度达到与标准曲线中相同吸光度时所代表的硫酸亚铁浓度（mmol·L-1）表示，其所代表的硫酸亚铁浓度越高，说明其抗氧化活性越高。

1.3.3 不同条件下异叶茴芹总黄酮对亚硝酸钠清除率的测定 （1）不同pH值下亚硝酸钠回归曲线的建立。取5组试管，分别移取0，0.2，0.4，0.6，0.8，1.0 mL 5 μg·mL-1的亚硝酸钠标准使用液于试管中。每组试管再各加入2.0 mL 不同pH值的磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液，放入恒温水浴锅中37 ℃水浴60 min，取出后立即加入2.0 mL用20%盐酸溶解的0.4%磺胺酸溶液，摇匀后放置4 min，加入1.0 mL 0.1% N-1-萘基乙二胺盐酸盐溶液，用移液管移取蒸馏水补充体积至25 mL，保鲜膜封试管口，上下摇晃至颜色均匀[14]。放置15 min，于538 nm波长下测吸光度，以亚硝酸钠浓度（μg·mL-1）为横坐标，吸光度为纵坐标绘制回归曲线。

（2）不同pH值下异叶茴芹总黄酮对亚硝酸盐清除率的测定。取5组试管，每组试管分别加入2.0 mL不同pH值的磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液，1.0 mL质量浓度为0.3 mg·mL-1的异叶茴芹总黄酮溶液，2.0 mL 5 μg·mL-1的亚硝酸钠标准液，用保鲜膜封口后，于37 ℃下水浴60 min，其余与1.3.3（1）中描述的操作步骤一致，最后在538 nm波长下测吸光度，记作Qi，在相同pH值下亚硝酸钠标准曲线中，计算出不加提取液时亚硝酸钠浓度的吸光度记作Q0，每组平行做3次，计算亚硝酸钠清除率的公式如下：

亚硝酸钠清除率=×100% （5）

（3）不同反应时间条件下异叶茴芹总黄酮对亚硝酸钠清除率的测定。取9支试管，加入2.0 mL pH值为3.0的磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液，其余操作与1.3.3（2）一致，用保鲜膜将试管口封住，放置在恒温水浴锅中37 ℃分别水浴10，20，30，40，50，60，80，

100，120 min，取出后，操作步骤同1.3.3（1），平行做3次，于538 nm波长下测吸光度，根据公式（5）计算亚硝酸钠清除率。

（4）不同浓度异叶茴芹总黄酮对亚硝酸钠清除率的测定。取试管若干，分别加入1 mL不同浓度的异叶茴芹总黄酮溶液，2.0 mL pH值为3.0的磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液，2 mL 5 μg·mL-1亚硝酸钠标准使用液，放置于恒温水浴锅中37 ℃水浴60 min，取出后操作步骤同上，计算亚硝酸钠清除率。

1.3.4 不同浓度异叶茴芹总黄酮的亚硝胺合成阻断率的测定 分别精密移取一定浓度梯度的异叶茴芹总黄酮稀释液于试管中，加入10.0 mL pH值为 3.0 的磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液，1.0 mL 1 mmol·L-1 的亚硝酸钠标准使用液，1.0 mL摩尔浓度为1 mmol·L-1的二甲胺溶液，在 37 ℃下恒温水浴60 min，用蒸馏水稀释至25 mL并摇匀，用移液枪吸取1.0 mL上述溶液加到小烧杯中，加入0.5 mL质量分数为0.5%的无水碳酸钠溶液，放置于超净工作台中，用紫外光照射15 min，取出后加入1.5 mL质量分数为1%的磺胺酸溶液，再加入1.5 mL用30%乙醇溶液溶解的质量分数为 0.1%的1-萘胺，蒸馏水 0.5 mL，摇匀后静置 15 min[21]。用可见分光光度计在525 nm波长处测吸光度，根据下式计算亚硝胺合成阻断率。

亚硝胺合成阻断率=×100% （6）

式中，W0是未加样液时的吸光度，Wy是加入样液后的吸光度。

2 结果与分析

2.1 异叶茴芹提取液中总黄酮的含量与提取率

芸香叶苷标准曲线的建立：以芸香叶苷对照品浓度（μg·mL-1）为横坐标，以吸光度为纵坐标绘制的标准曲线见图1，回归方程为：y = 0.01x + 0.015，R2 = 0.997 6，具有良好的线性关系。

异叶茴芹提取液测得的吸光度平均值为0.310，标准差为0.003，代入标准曲线得出总黄酮浓度为29.5 μg·mL-1，代入公式（1）可知异叶茴芹提取液中总黄酮的提取率为8.85%。

2.2 异叶茴芹总黄酮的抗氧化活性

2.2.1 羟基自由基的清除率 Fenton反应体系中产生的羟基自由基可以被水杨酸捕获，生成的物质在510 nm波长处有强吸收。若加入具有清除羟基自由基能力的抗氧化剂，便会与水杨酸产生竞争，利用分光光度计测其吸光度，便可根据公式计算被测物对羟基自由基的清除能力。

图2结果表明，异叶茴芹总黄酮和Vc对羟自由基具有一定的清除作用。异叶茴芹总黄酮和Vc在质量浓度为2.0 mg·mL-1时的羟基自由基清除率分别达到了18.88%和8.76%。从总体的走势来看，异叶茴芹总黄酮比Vc具有更强的羟基自由基清除能力，且随着浓度的升高而不断增大。

2.2.2 超氧阴离子自由基清除率 焦性没食子酸在pH值大于7.0时，会产生有色中间物与超氧阴离子，而超氧阴离子会进一步促进焦性没食子酸产生更多的有色中间物，该有色中间物在420 nm处有最大吸收峰。黄酮类物质中的酚羟基会与超氧阴离子形成稳定的结构，从而使超氧阴离子失去氧化能力，因此，可以利用有色中间物产生的多少来判断待测液的抗氧化活性[23]。

由图3可知，异叶茴芹总黄酮对超氧阴离子自由基具有一定的清除能力，且浓度与清除力呈正相关关系，刚开始时增幅较大，后趋于平缓。当浓度达到0.1 mg·mL-1时，异叶茴芹总黄酮和Vc的超氧自由基清除率分别达到了16.23%和31.09%，由此说明，异叶茴芹总黄酮具有较强的抗氧化活性，但低于同浓度Vc的抗氧化性。

2.2.3 还原力 抗氧化剂能将铁氰化钾还原为亚铁氰化钾，后者与三氯化铁反应生成普鲁士蓝，其在700 nm波长处有强吸收。从这个角度来讲，吸光度越高，说明待测液抗氧化活性越好。

由圖4可知，异叶茴芹总黄酮及Vc都有一定的还原力，且随着样液浓度的增加而增大，初始时，在浓度相同的情况下，异叶茴芹总黄酮提取液的还原力稍低于Vc溶液，之后异叶茴芹总黄酮的还原力增长平缓，而Vc的还原力增长较快，两者差距逐渐增大。总的来说，Vc的还原力强于异叶茴芹总黄酮，这与同属伞形科的小茴香测出的还原力与Vc的比较结果一致[24]。

2.2.4 FRAP法测定抗氧化活性 硫酸亚铁浓度的标准曲线如图5所示：y = 5.847 1x + 0.005 1，R2 = 0.997 8。

从图6可以看出，异叶茴芹总黄酮与Vc都具有一定的还原性，在0.4～2 mg·mL-1的浓度范围内，两者的FRAP值随着浓度的增加而增高，且在相同浓度下，Vc的抗氧化效果优于异叶茴芹总黄酮，其原因为亚铁离子能够减弱黄酮类化合物的抗氧化性[24]。此外，异叶茴芹总黄酮及Vc的浓度与FRAP值呈一定的线性回归关系，其回归方程分别为y = 0.026 9x-0.027 5，R2=0.999 9;y=0.078 2x-0.091 7，R2= 0.987 7。

2.3 异叶茴芹总黄酮在不同条件下对亚硝酸钠的清除率

2.3.1 不同pH值下亚硝酸钠的标准曲线 在pH值小于7.0的条件下，亚硝酸盐与磺胺酸反应后会与N-1-萘基乙二胺盐酸盐偶合形成紫红色物质，在538 nm处用分光光度法建立标准曲线测得亚硝酸盐含量。

不同pH值下亚硝酸钠的标准曲线见表2，从斜率角度看，当pH值在2.2～4.6时，亚硝酸钠标准曲线的斜率是不断增大的，当pH值为5.4时，斜率又降为0.028 5。

2.3.2 不同pH值下异叶茴芹总黄酮对亚硝酸钠的清除率 由图7可知，在加入浓度为0.3 mg·mL-1异叶茴芹总黄酮后，亚硝酸钠的清除率随着pH值的升高显著降低。其原因是在较低的pH值条件下，亚硝酸钠可转化为亚硝胺，然后生成N2O2，其可被总黄酮还原为NO，而在pH值较高时，亚硝酸钠不容易被还原[26-27]。故在低pH值条件下，有利于异叶茴芹总黄酮对亚硝酸钠的清除。

2.3.3 不同反应时间下异叶茴芹总黄酮对亚硝酸钠的清除率 由图8可知，在加入相同浓度的异叶茴芹总黄酮后，亚硝酸钠清除率在20～80 min范围内不断增加，在80 min时清除率达到了65.16%，在100 min时略有下降，之后在120 min时又有上升的趋势，而且清除率达到了70.69%，高于80 min时的亚硝酸钠清除率。

2.3.4 不同浓度异叶茴芹总黄酮对亚硝酸钠的清除率 由图9可知，在总体趋向上，亚硝酸钠的清除率随着异叶茴芹总黄酮浓度的增加稍有上升，异叶茴芹总黄酮浓度为1.2 mg·mL-1时，亚硝酸钠的清除率达到最高，为61.69%。

2.4 不同浓度异叶茴芹总黄酮的亚硝胺合成阻断率

在pH值小于7.0的环境条件下，二甲胺与亚硝酸钠反应生成的产物在紫外光灯下照射后分解出的亚硝酸盐，其与磺胺酸发生重氮化后会与1-萘胺反应生成紫红色产物。当在样液中加入二甲胺与亚硝酸钠时，总黄酮与二甲胺对亚硝酸根的反应产生竞争，以此达到阻断亚硝胺的合成的目的。

由图10可以看出，随着异叶茴芹总黄酮浓度与亚硝胺合成阻断率呈正相关，开始时稍有上升，之后上升平缓，在其浓度为1 mg·mL-1时，亚硝胺合成阻断率达到了50.69%。

3 结论与讨论

在试验中，异叶茴芹的提取率低于文献中的提取率16.98%[17]，这可能与异叶茴芹的来源、洗脱叶绿素的时间和试剂生产厂家等不同有关。在羟基自由基的清除中，异叶茴芹总黄酮优于Vc，其原因为三价铁离子与黄酮类化合物中的羟基或邻位羟基及邻位酮基配位，稳定了中间产物，有利于异叶茴芹总黄酮对羟基自由基的清除[22]。对于Vc的还原力高于异叶茴芹总黄酮，这可能是由于Vc为单一物质，而总黄酮中含有多种不同结构的黄酮类化合物，他们之间可能存在相互作用，致使其还原力不如Vc [25]。

本试验采用超声辅助乙醇浸提法提取异叶茴芹总黄酮，得到的总黄酮浓度为2.95 mg·mL-1，提取率为8.85%。在抗氧化性方面，异叶茴芹总黄酮具有较好的抗氧化活性。在羟基自由基的清除上，异叶茴芹总黄酮优于同等浓度的Vc，另外三种测抗氧化活性的方法中，Vc的抗氧化活性好于异叶茴芹总黄酮。此外，异叶茴芹总黄酮在较低pH值、一定的浓度和作用时间内，能够有效的清除亚硝酸钠，在pH值为3.0的时候，异叶茴芹总黄酮在试验浓度范围内，能有效地抑制亚硝胺的合成。与本次试验中所用到的化学抗氧化方法相比，以细胞为反应主体的CAA法更接近人体的生理条件，生物相关性也更强，具有一定的实际意义[28]。但该方法也有一些困難需要克服，例如，如何将CAA的结果与动物体内试验的结果相联系，试验方法复杂等问题，这些需要进一步探讨[29]。有研究发现异叶茴芹中还含有香豆素、鞣质、皂苷等成分[3]，所以应该进一步探究其各个成分的功能，以期更好地利用和开发异叶茴芹。

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