长非编码RNA GABPB1-AS1调控氧化应激适应性 线粒体生成的机制研究

徐 思，李 野

（四川师范大学 体育学院，四川 成都610100）

0 引言

运动诱导的线粒体生成是运动性适应的主要标志（Little et al.,2011），也是运动训练促使运动能力增强的生理基础（郑莉芳 等,2018）。运动应激适应性线粒体生成依赖组织细胞对运动诱导的细胞氧化应激状态的感知，并启动下游调控线粒体生成因子的激活（Margaritelis et al.,2018），但其分子机制目前尚无定论。

长非编码RNA（long non-coding RNA，lncRNA）是真核细胞中发现的一类长度大于200 nt的RNA分子，一般不编码蛋白质，多数具有mRNA样结构（经过剪切，具有PolyA尾巴，与启动子有结合能力），是基因表达调控网络的不可或缺的组成部分（Hung et al.,2010），调控作用范围涉及转录水平、转录后水平及表观遗传水平（Salmena et al.,2011），以信号分子、诱饵分子、引导分子、骨架分子等方式在细胞增殖、分化、应激适应、自噬以及死亡过程中呈现多重调控机制（Mercer et al., 2009）。氧化应激是调控应激适应发生的基本信号通路（Araki et al.,2016; Bisht et al.,2017; Kandola et al.,2015; Schieber et al.,2014），LncRNA在多个层次参与应激适应相关的氧化应激信号通路调控（Chen et al.,2014; Fuschi et al., 2019; Tehrani et al.,2018），是调节应激适应性组织结构与功能重塑的主要调控分子（史华俊 等,2012; Mercer et al.,2013; Valadkhan et al., 2016），而LncRNA在运动应激诱导的氧化应激应答与涉及线粒体生成的正性适应调控通路和机制上的相关分子及其作用仍然有待阐明。

GABPB1-AS1是核呼吸因子2β1亚基（GABPB1）（Hayashi et al.,2013）的反义RNA，全长4 139 nt，仅见于人类基因组。GABPB1-AS1是定位于细胞质的短寿LncRNA，一般状态下半衰期很短，因而在细胞质中含量很低（Tani et al.,2013）。在多种因素导致的细胞氧化应激状态下，GABPB1-AS1在细胞质中积累，积累程度与氧化应激刺激强度成正比（Tani et al.,2014），并且与细胞生存率呈正相关（Alkhateeb et al.,2019）。目前尚不清楚GABPB1-AS1这一表达特征的生理意义以及分子机制。

本研究检测人源细胞氧化应激模型中GABPB1-AS1在应激因素消除后的表达特征及其对线粒体生成调控通路关键因子的调控作用，探讨其在应激适应性线粒体生成过程中的调控信号通路和作用机制。

1 材料与方法

1.1 细胞株

人脐静脉内皮细胞（human umbilical vein endothelial cells，HUVEC）由本实验室保存。

1.2 主要试剂

双氧水购买于上海阿拉丁生化科技股份有限公司；DMEM（dulbecco minimum essential medium）培养基和0.25%胰蛋白酶（美国Hyclone公司）；胎牛血清（fetal bovine serum，FBS）（美国Gibco公司）；Lipofectamine 2000（Thermo Scientific）；ribo FECTTM CP转染试剂（广州锐博生物科技有限公司）；逆转录试剂盒（Thermo Scientific）；实时定量PCR（real time quantitative PCR，qRT-PCR）试剂（美国Kapa Biosystems公司）；miR-101 mimic和inhibitor以及对应的negative control（广州锐博生物科技有限公司）；RiboLock RNase Inhibitor（100 U/ml）、RNase A+T、RNA提取试剂盒、蛋白定量试剂盒、体外转录试剂（Thermo Scientific）；ACTIN抗体和辣根过氧化物酶（horseradish peroxidase，HRP）标记羊抗兔/小鼠二抗、GABPB1、PCG-1α抗体（ProteinTech）；胶回收试剂盒（美国Promega公司）；本研究使用的引物及寡聚核酸均由上海吉玛生物科技有限公司设计并合成（表1）。

表1 本研究使用的引物和寡聚核酸序列 Table 1 Primers and Oligonucleic Acid Sequences

1.3 细胞培养及干预方案

HUVEC细胞采用DMEM培养基（含10% FBS、100 U/ ml penicillin、100 μg/ml streptomycin），于CO2培养箱（37℃，5% CO2）中培养。使用0.25%胰蛋白酶消化细胞，进行传代培养或其他实验。

采用终浓度200 μM的H2O2处理HUVEC细胞3 h，构建细胞氧化应激模型。作用3 h后洗脱H2O2，更换培养基继续培养，分别于2 h、4 h、8 h、16 h、24 h收集细胞用于核酸及蛋白质检测等试验。以正常培养HUVEC细胞作为对照，记为0 h。

1.4 细胞转染

GABPB1-AS1的小干扰RNA（small interfering RNA，siRNA）和对照组NC序列见表1。GABPB1-AS1过表达质粒的构建方法：使用GABPB1-AS1序列引物对（表1）从HUVEC细胞cDNA中扩增片段，使用NheI 与BamHI酶切质粒后将片段插入pcDNA3.1载体中。

取生长状态良好的HUVEC细胞均匀铺于6孔板，将细胞密度控制在30%左右，12 h后进行转染操作，miR-101 mimic和inhibitor以及对应的negative control使用ribo FECTTM CP转染试剂按照说明书步骤进行转染操作，GABPB1-AS1 siRNA和过表达质粒使用Lipofectamine 2000进行转染。

1.5 RNA抽提和qPCR-RCR检测

转染48～72 h后，收集各组细胞。按照试剂盒说明书提取细胞总RNA，用分光光度计检测OD260/D280得到RNA浓度，再按逆转录试剂盒说明书操作得到cDNA。qRT-PCR检测按照说明书操作，反应体系20 μl，反应程序：94℃ 3 min，94℃ 10 s，60℃ 15 s，72℃ 20 s，40个循环。数据分析采用相对定量法（2-ΔΔCT）。GAPDH基因作为定量实验的内参，引物序列见表1。

1.6 蛋白提取和western bloting实验

收集转染的各组细胞，用预冷的PBS清洗细胞2次，加入蛋白酶抑制剂（PIC，Roche）的细胞裂解液在冰上裂解20 min，涡旋5次，每次10 s。4℃、13 000 rpm/min 离心10 min，收集上清液，BCA法测定蛋白浓度。将得到的蛋白溶液和上样缓冲液按5:1混合，煮沸10 min，得到细胞总蛋白样品。采用10% SDS-PAGE分离胶电泳分离细胞总蛋白，湿转法将蛋白从SDS-PAGE胶转移至硝酸纤维素膜，电转结束后，5%脱脂奶粉室温封闭1 h，将硝酸纤维素膜分别置于抗体稀释液中，4℃孵育过夜。使用PBST（PBS+0.2% Tween20）漂洗5次，每次5 min，再将洗脱后的膜置于HRP标记的二抗稀释液（稀释比例1:10 000），室温孵育1 h，再漂洗5次，每次5 min，显影。以ACTIN作为内参蛋白。

1.7 GABPB1-AS1/miR-101-RNA pull down实验

GABPB1-AS1（包含miR-101结合位点区域）序列克隆至载体pcDNA3.1，PCR引物序列见表1，将构建好的载体用BamH I酶切后，使用Roche体外转录试剂盒进行体外转录和生物素标记。转录结束后，加入DNase I消化转录模板，使用TRIzol抽提体外转录产物，定量后取3 ug RNA与HUVEC细胞提取液混合进行RNA pull down实验。反应体系为25 mM Tris-Cl [pH 7.4]，150 mM NaCl，0.5% NP-40，0.5 mM DTT and 1×complete protease inhibitors（Roche），室温孵育2～4 h后加入链霉素偶联的T1 beads（Roche），孵育30 min后，洗脱5次，抽提RNA，逆转录后qRT-PCR检测吸附的miR-101。

1.8 GABPB1-AS1/GABPB1 RNA pull down实验

分别将GABPB1第1外显子正义方向序列（1～447 nt）和反义方向序列（1～447 nt）按1.7方法体外转录和生物素标记，转录结束后，加入DNase I消化转录模板，使用TRIzol抽提体外转录产物，定量后各取3 ug RNA分别与HUVEC细胞提取液混合进行RNA pull down实验。用于检测GABPB1-AS1对GABPB1的亲和作用的HUVEC细胞提取液（反应体系同前）加入100 U/ml的RNase-inhibitor，室温孵育1 h后加入链霉素偶联的T1 beads（Roche），孵育30 min后，洗脱5次，抽提RNA，逆转录后qRT-PCR检测吸附的GABPB1序列。

1.9 RNase保护试验（RNase protection assay，RPA）

如前所述的HUVEC细胞分离的RNA置于37℃ 1 h，然后用RNase A+T 37℃处理30 min。RNase A+T能降解单链RNA，但不能降解双链RNA。RNase A+T处理后，用TRIzol提取RNA，生成cDNA，进行qRT-PCR检测。

1.10 数据处理

数据用SPSS17.0软件处理，以均数±标准差表示。采用独立样本t检验确定两组间均值差异的显著性，显著性水平差异为P＜0.05。

2 实验结果

2.1 GABPB1-AS1在氧化应激诱导下高表达，上调PGC-1α蛋白水平

HUVEC细胞经200 μM的H2O2作用3 h后细胞边界略见皱缩，数量减少约10%，其他未见显著异常（图1A）。

qRT-PCR检测H2O2作用后继续培养2 h、4 h、8 h和16 h的HUVEC细胞的GABPB1-AS1的表达水平，结果显示，H2O2处理的GABPB1-AS1在2 h和4 h表达水平增高至3.468倍和3.640倍，均显著高于正常培养的HUVEC细胞（P＜0.01），8 h和16 h表达水平略下降，分别为2.77倍和2.20倍，显著高于正常培养的HUVEC细胞中GABPB1-AS1（P＜0.01，P＜0.05）。采用western bloting检测对应时段PGC-1α蛋白表达，结果显示，与正常培养的HUVEC细胞中PGC-1α蛋白水平相比，2～16 h PGC-1α蛋白水平均显著提高（图1B）。

采用siRNA敲低HUVEC细胞的GABPB1-AS1，western bloting检测其对PGC-1α蛋白水平的影响。结果表明，敲低GABPB1-AS1后PGC-1α蛋白水平下降（图1C）。

构建GABPB1-AS1过表达质粒转染HUVEC细胞，western bloting检测其对PGC-1α蛋白水平的影响。结果表明，过表达GABPB1-AS1后PGC-1α蛋白水平升高（图1D）。

图1 H2O2氧化应激诱导高表达的GABPB1-AS1调控PGC-1α蛋白水平上调 Figure 1.The Overexpression of GABPB1-AS1 which was Induced by H2O2 Oxidative Stress Up-regulates the Protein Level of PGC-1α

2.2 1-AS1通过竞争性吸附miR-101，降低其对PGC-1α-mRNA翻译的抑制作用

生物信息分析显示，miR-101种子区与GABPB1-AS1在chr15:50655684-50655705位置存在强结合点，同时miR-101种子区在PGC-1α的3'UTR有结合位点（http:// www.targetscan.org/cgi-bin/targetscan/vert_72）（图2A）。

采用RNA pull down实验，利用体外转录的GABPB1-AS1结合HUVEC细胞中内源miR-101，qRT-PCR检测与GABPB1-AS1结合的miR-101。结果显示，与GABPB1-AS1结合的miR-101显著高于对照组（P＜0.01，图2B）。

分别采用miR-101的mimic和inhibitor转染HUVEC细胞，western bloting检测转染mimic和inhibitor的 HUVEC细胞中PGC-1α蛋白水平。结果表明，转染miR-101 mimic的HUVEC细胞中PGC-1α蛋白水平低于空白对照组；转染inhibitor的HUVEC细胞中PGC-1α蛋白水平高于空白对照组（图2C）。

以上结果提示，存在GABPB1-AS1/miR-101/PGC-1α调控轴，在氧化应激刺激下，GABPB1-AS1半衰期延长，在细胞质内含量升高，通过“海绵效应”竞争性结合miR-101，解除miR-101结合于PGC-1α mRNA的3'UTR区域的翻译抑制作用，促进PGC-1α mRNA翻译，提高PGC-1α蛋白水平（图2D）。

图2 GABPB1-AS1竞争结合miR-101上调PGC-1α蛋白质翻译 Figure 2.GABPB1-AS1 Competitively Binds to miR-101 to Up-regulate the Translation of PGC-1α

2.3 氧化应激高表达的GABPB1-AS1对GABPB1 mRNA的稳定性和蛋白水平的调控作用

采用200 μM的H2O2处理3 h后，去除H2O2，继续培养细胞，qRT-PCR检测2 h、4 h、8 h、16 h、24 h的GABPB1-AS1及其正义链的RNA水平，western bloting检测对应的GABPB1蛋白水平。结果显示，GABPB1-AS1与其正义链mRNA表达水平协同性改变，2～4 h维持高表达水平，但GABPB1蛋白水平降低，8～24 h GABPB1正反义链mRNA均逐渐降低至基线水平左右，而GABPB1蛋白升高（图3A）。

构建载体在HUVEC细胞中直接过表达GABPB1-AS1，结果表明，GABPB1 mRNA和蛋白质水平均显著下降（图3B）。

生物信息学分析表明，GABPB1-AS1与其正义链的前端有449 nt的互补序列，其中包含GABPB1基因的第一外显子序列全长（1～424 nt）（图3C）（https://www.ncbi.nlm.nih. gov/gene/100129387），提示，GABPB1-AS1可能与其正义链在细胞质中以互补结合的二聚体形式存在，并调节其正义链的稳定性和表达行为。

采用RNA pull down实验，利用体外转录的生物素标记的GABPB1-AS1 mRNA的前端1～447 nt序列结合内源GABPB1以验证二者的结合关系，同时用RPA试验检测正反义链重叠聚合状态对RNaseA+T降解GABPB1 mRNA的保护作用，分析GABPB1-AS1与GABPB1 mRNA的结合性、结合位点以及对mRNA稳定性的影响。结果表明，体外转录的GABPB1-AS1与内源GABPB1 mRNA可以在1～447 nt区域直接结合，结合反义链的GABPB1 mRNA水平与加入RNase抑制剂的GABPB1 mRNA水平无显著差异，而单链GABPB1 mRNA被RNase降解而显著降低。证明内源性正反义链也处于结合状态，GABPB1 mRNA与其反义链形成二聚体结构可以促进其稳定性，防止被RNase降解（图3D）。

以上结果提示，氧化应激诱导GABPB1-AS1及其正义链mRNA高表达，二者重叠区域互补结合，维持GABPB1 mRNA稳定，应激结束后，GABPB1-AS1半衰期恢复，加速降解，释放GABPB1 mRNA翻译，上调其蛋白水平（图3E）。

图3 氧化应激状态GABPB1-AS1结合GABPB1 mRNA保持其稳定并调控其应激后表达 Figure 3.GABPB1-AS1 Binds to GABPB1 mRNA to Maintain its Stability and Regulate its Expression after Oxidative Stress

3 讨论

本研究实验证据表明，氧化应激诱导高表达的LncRNA GABPB1-AS1在应激结束后调控适应阶段的PGC-1α翻译水平上调，其机制是通过海绵作用吸附miR-101，解除其对PGC-1α mRNA翻译的抑制作用。同时，本研究显示，LncRNA GABPB1-AS1是核质互作信号分子。氧化应激条件下GABPB1-AS1维持其正义链mRNA稳定，应激结束后释放正义链mRNA表达蛋白，其生理意义为调控GABPB1 mRNA翻译和NRF2入核，协同PGC-1α调节适应性线粒体生成。这是人类特有的应激适应性线粒体生成机制。

细胞氧化应激状态是运动应激的直接结果和基本状态（Thirupathi et al.,2017），运动应激诱导的活性氧（ROS）是运动适应性调控的重要信号途径（Radak et al.,2013），线粒体生成和抗氧化适应是运动性适应的标志性特征（Perry, 2017）。PGC-1α是调控线粒体生物合成的关键调节蛋白，能够激活大量线粒体代谢功能与抗氧化功能相关蛋白的表达（Petr et al.,2018），运动应激可以通过上调PGC-1α途径启动线粒体生成（孙易 等 2017）。研究表明，多种因素导致的氧化应激及化学损伤性应激均可以显著上调GABPB1-AS1细胞含量，上调程度与应激强度和持续时间成正比（Alkhateeb et al.,2019）。我们研究了应激因素消除后GABPB1-AS1的表达行为及其对适应性线粒体生成的调控作用。实验结果表明，氧化应激诱导高表达的GABPB1-AS1含量在应激因素消除后逐渐下降，最终恢复至基线水平，在此过程中，PGC-1α蛋白水平增高。过表达GABPB1-AS1具有相同的作用，而敲低GABPB1-AS1则抑制PGC-1α蛋白水平。前期试验结果表明：200 μM的H2O2刺激HUVEC细胞3 h对PGC-1α的mRNA水平没有显著影响，提示，GABPB1-AS1在转录后水平促进PGC-1α的表达。生物信息学分析表明，miR-101在GABPB1-AS1序列及PGC-1α mRNA的3'UTR上均有结合位点。已有研究表明，miR-101参与神经细胞氧化应激应答（Li et al.,2015）。本研究采用RNA pull-down实验证明，GABPB1-AS1与miR-101可以互补结合。并且证明，上调miR-101表达可以下调PGC-1α蛋白水平，抑制miR-101水平则PGC-1α蛋白水平上调。综合以上结果认为，miR-101可以通过结合于PGC-1α mRNA的3'UTR抑制其翻译过程，GABPB1-AS1是定位于细胞质的RNA，与miR-101互补结合，应激状态下细胞质内高水平的GABPB1-AS1竞争性吸附miR-101，解除其对PGC-1α翻译的抑制作用，上调其蛋白水平。

GABPB1-AS1的正义链编码核呼吸因子-2β1亚基（NRF-2β1，又称为GA结合蛋白β1亚基，即GABPB1）促进线粒体基因表达（Ongwijitwat et al.,2006）并引导NRF-2入核（Hayashi et al.,2013）与PGC-1α蛋白共同调节多数线粒体能量代谢基因的表达，促进线粒体生物合成（Goffart et al.,2003），直接影响人体有氧运动能力（He et al.,2015; Maciejewska-KarŁowska et al.,2012），是重要的线粒体核质互作调控因子。研究表明，多种因素引起的氧化应激均可以引起GABPB1-AS1显著高表达（Tani et al.,2014）。本研究证实，氧化应激条件下GABPB1-AS1与GABPB1表达水平协同上调，并在应激因素消除后协同下降，但仅过表达GABPB1-AS1则会下调GABPB1的mRNA和蛋白质表达水平。这一结果提示，GABPB1-AS1作为信号分子参与细胞核质互作机制对氧化应激的应答，维持GABPB1 表达水平与线粒体功能状态相协调。

LncRNA反义链通常会通过互补结合对其正义链及其表达产物产生调控作用，影响其mRNA的稳定性以及翻译行为（Canzio et al.,2019）。生物信息分析显示，GABPB1-AS1与其正义链在头部有449个碱基互补（chr15：50354959～50355408），二者可以通过碱基互补配对形成二聚体结构。本研究RNA pull down实验和RPA实验结果证实，GABPB1-AS1与其正义链前端1～447 nt互补重叠形成二聚体结构，这一结构防止GABPB1 mRNA被RNase降解，维持其在氧化应激状态下的稳定性。相比于应激结束后从头表达GABPB1，这一方式更有利于快速调节线粒体适应（de Nadal et al.,2011）。

本研究结果显示，H2O2刺激后2～8 h，GABPB1-AS1和GABPB1 mRNA水平均显著增高，但GABPB1蛋白水平下降，16～24 h GABPB1-AS1和GABPB1 mRNA水平下降，而GABPB1蛋白水平显著增高。这一结果提示我们，GABPB1-AS1与其正义链的二聚体结构在稳定GABPB1 mRNA的同时也阻止其翻译，其生理意义可能是在细胞受氧化应激影响导致内环境尚未恢复稳态的条件下储备mRNA的同时，防止蛋白质发生修饰或折叠错误。当内环境稳态恢复后，GABPB1-AS1半衰期逐渐恢复，加速降解，释放出正义链mRNA结合核糖体进行翻译，使GABPB1蛋白水平显著提高，促进NRF-2入核，协同PGC-1α调节线粒体生成。氧化应激适应过程中GABPB1-AS1半衰期调节及其对GABPB1 mRNA的释放作用的具体机制，还有待进一步阐明。

4 结论

氧化应激诱导高表达的LncRNA GABPB1-AS1在应激适应阶段通过GABPB1-AS1/miR-101/PGC-1α轴上调PGC-1α蛋白水平，调控应激适应性线粒体生成，GABPB1-AS1作为核质互作信号分子参与氧化应激适应性应答，调控其正义链编码蛋白GABPB1协同促进这一过程。GABPB1-AS1参与调控的线粒体生成调控机制是人类特有的应激适应机制。