女性昼夜节律与急性冠脉综合征的相关性

张再强 丁家望 李相萱 汪心安 罗彩云 余彬 尚白雪

(三峡大学第一临床医学院 宜昌市中心人民医院心内科，湖北 宜昌 443003)

心血管疾病已经成为女性死亡率升高的主要原因之一〔1〕。虽然传统意义上心血管疾病更倾向于男性，但是随着医疗技术的不断发展及人们对于心血管疾病的认识程度不断提高，男性心血管疾病死亡率在逐年降低，然而由于对女性心血管疾病的研究较少，发病率和死亡率仍然很高。据统计，目前中国女性因心血管疾病死亡人数占总死亡人数的1/3以上〔2〕。研究发现，女性急性冠脉综合征患者在发病前大多数都有一段时间的睡眠质量下降、情绪低落等影响生活质量的情况，而这些改变都会导致人体正常的昼夜节律的改变〔3，4〕。本研究选取女性急性冠脉综合征患者，并以同时间段入院的女性冠脉正常患者作为对照，探讨女性昼夜节律紊乱与急性冠脉综合征的发生及冠脉狭窄严重程度的相关性。

1 对象与方法

1.1 研究对象 选择宜昌市中心人民医院2016年11月至2017年8月住院患者86例，分为:①女性冠脉正常组(A1组)20例；②女性不稳定性心绞痛(A2)组32例；③女性急性心肌梗死(A3)组34例。根据美国心脏协会(AHA)及欧洲心脏病学会(ESC)，诊断标准如下：正常组：冠脉造影显示无冠脉血管病变。不稳定性心绞痛：①无明显心肌标记物的升高；②有心肌缺血的症状；③心电图表现出短暂的ST段压低和(或)T波平坦、倒置或罕见的ST段抬高。急性心肌梗死：心肌标记物〔肌钙蛋白或肌酸激酶同工酶(CK-MB)〕超过正常上限的99%分位，同时具备下述诊断标准至少1条：①有心肌缺血的症状；②心电图上新出现显著的 ST-T 改变或左束支传导阻滞；③心电图出现病理性Q波；④冠脉造影提示冠脉狭窄。排除标准：①1年以内的心脑血管事件，如脑卒中、心肌梗死等；②低密度脂蛋白胆固醇 ≥4.3 mmol/L；③恶性肿瘤；④肾衰竭；⑤肝脏疾病；⑥自身免疫性疾病。受试者均行冠脉造影检查且经医院伦理委员会批准，签署知情同意书。

1.2 基本资料的收集 记录入选患者的基本临床资料，包括：年龄、体重指数(BMI)、糖尿病病史、高血压病史、吸烟史、饮酒史等。

1.3 冠状动脉造影 采用荷兰philips FD20型数字减影血管造影，选用Judkins法，经股动脉或桡动脉，应用标准技术行冠状动脉造影。冠状动脉造影由2名心内科介入医师操作和分析。左冠状动脉造影至少从4个角度造影，右冠状动脉至少从2个角度造影。同时记录冠状动脉病变的部位。Gensini评分〔5〕：冠状动脉狭窄程度的分析根据AHA规定的采用Gensini积分系统，对每支血管进行定量评分，其评分标准由两部分组成：①根据冠脉狭窄程度确定基本评分：无任何狭窄的0分；狭窄程度<25%，1分；≥25%且<50%，2分；≥50%且<75%，4分；≥75%且<90%，8分；≥90%且<99%，16分；≥99%，32分。②根据冠状动脉病变部位确定评分系数：即左主干(LM)病变×5.0；左冠状动脉前降支(LAD)近段病变×2.5；LAD中段病变×1.5；LAD远段病变×1.0；对角支病变：第一对角支病变×1.0；第二对角支病变×0.5；左冠状动脉回旋支(LCX)近段病变×2.5；LCX远段病变×1.0；后降支病变×1.0；后侧支病变×0.5；右冠状动脉(RCA)近、中、远段病变均×1.0。各患者病变累计积分之和即为其冠状动脉病变狭窄程度的总积分。

1.4 睡眠质量评估 患者均进行阿森斯失眠量表(AIS)及匹兹堡睡眠质量指数量表(PSQI)评分。

1.5 血液检测 受试者入院后次日清晨空腹采集前臂静脉血，于宜昌市中心人民医院检验科采用酶法检测血糖、血脂、肝肾功能、血肌酐(Scr)、C反应蛋白(CRP)及心肌酶。

1.6 实时荧光定量PCR(qRT-PCR)检测 昼夜节律基因Bmal1和Clock及基质金属蛋白酶(MMP)2及MMP9 mRNA表达采用qRT-PCR检测。从采集到的外周抗凝血提取单个核细胞，按总RNA提取试剂盒(Lot DP419，TIANGEN Biotech，China)说明书提取总RNA，以提取的总RNA为模板，按照cDNA反转录试剂盒(Lot 00422877，Thermo Scientific，USA)说明书以42℃ 60 min，25℃ 5 min，70℃ 5 min进行逆转录合成cDNA，合成的cDNA立即用于后续实验，或在-20℃下储存。根据SYBRP®Premix Ex TaqTM Ⅱ (Lot RR820A，Takara，Japan) 说明书操作，反应条件为：95℃预变性2 min，95℃ 15 s；60℃ 30 s；72℃ 30 s，40个循环，然后60℃延伸30 s，循环结束后得到扩增曲线。引物序列：GADPH上游引物：5′-AGGTCCACCACTGACACGTT-3′；下游引物：5′-GCCTCAAGATCATCAGCAAT-3′；Bmal1上游引物：5′-GAGCAGCTCTCCTCCTCTGA-3′；下游引物：5′-CGTCGTGCTCCAGAACATAA-3′；Clock上游引物：5′-AGAGCACCTTCCCTCAGTCA-3′；下游引物：5′-GCACGTGTGCTACTGTGGTT-3′；MMP2上游引物：5′-ACCTGAAGCTGGAGAACCAA-3′；下游引物：5′-TATCGAAGGCAGTGGAGAGG-3′；MMP9上游引物：5′-CGACGTCTTCCAGTACCGAG-3′；下游引物：5′-TTGTATCCGGCAAACTGGCT-3′。按照上述反应体系及反应条件完成操作，采用2-ΔΔCt比较量化法对qRT-PCR结果进行分析。

1.7 统计学分析 运用SPSS18.0软件进行单因素方差分析，独立样本t检验，χ2检验，Pearson分析。

2 结 果

2.1 各组一般临床资料比较 在年龄、BMI、Scr、总胆固醇(TC)、三酰甘油(TG)、高密度脂蛋白胆固醇(HDL-C)、低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)、吸烟史、饮酒史、糖尿病和高血压等指标方面，3组无统计学差异(P>0.05)；A3组空腹血糖、CRP、谷丙转氨酶(ALT)、谷草转氨酶(AST)明显高于A1组和A2组(P<0.05)，见表1。

2.2 各组睡眠情况比较 对于睡眠质量AIS评分和PSQI评分，A3组明显高于A2组和A1组(P<0.05)，见表1。

2.3 各组冠状动脉狭窄程度比较 A3组Gensini评分明显高于A2组与A1组(P<0.05)，且A2组明显高于A1组(P<0.05)。 见表1。

表1 各组临床资料、睡眠质量和Gensini评分比较

与A1组比较：1)P<0.05；与A2组比较：2)P<0.05；表2同

2.4 各组外周血昼夜节律基因Bmal1和Clock mRNA表达 昼夜节律基因Bmal1和Clock mRNA表达，A1组明显高于A2组和A3组(P<0.05)，A2组明显高于A3组(P<0.05)，见表2。

2.5 各组外周血MMP2和MMP9 mRNA表达 MMP2和MMP9 mRNA表达，A3组明显高于A2组和A1组(P<0.05)，A2组明显高于A1组(P<0.05)，见表2。

2.6 昼夜节律基因Bmal1和Clock mRNA的表达水平与Gensini评分相关性 Bmal1、Clock mRNA表达水平均与Gensini评分呈显著负相关(r=-0.708 4、-0.680 4，P<0.000 1)，见图1。

表2 各组Bmal1、Clock 、MMP2、MMP9 mRNA表达比较

图1 女性急性冠脉综合征患者昼夜节律基因Bmal1和Clock mRNA的表达水平与Gensini评分相关性

3 讨 论

本研究说明女性患者睡眠质量下降与急性冠脉综合征的发生密切相关。女性昼夜节律紊乱与急性冠脉综合征的发生有关，并且与斑块的稳定性相关。

睡眠时间不足，睡眠质量下降可以导致肥胖、糖尿病、高血压和心脑血管疾病〔6～8〕。Sharma等〔9〕发现睡眠质量差或每天睡眠时间小于6 h会增加心血管疾病的风险。国内外的一些研究也表明当睡眠质量下降，睡眠时间缩短时，会导致交感神经异常兴奋，血压升高，心率变异性降低；内皮细胞功能障碍，血管舒张-收缩功能异常；激素分泌紊乱；炎症因子(CRP、白细胞介素、肿瘤坏死因子等)分泌增多；糖脂代谢紊乱〔10～12〕。而这些都是动脉粥样硬化、急性冠脉综合征发生的重要危险因素。本研究中也观察到当女性患者睡眠质量越差时，冠脉病变越严重。

生物体昼夜节律的稳定主要是由Bmal1和Clock组成的异二聚体来调控的。研究发现小鼠生物钟基因的改变可以影响动脉粥样硬化的形成，全Bmal1基因敲除Apoe-/-Ldlr-/-小鼠后给予普通饮食或高脂饮食都会加快主动脉动脉粥样硬化的进程，同样Apoe-/-小鼠骨髓细胞特异性敲除Clock基因也会加快动脉粥样硬化的进程〔13〕。将野生型小鼠主动脉移植到Bmal1-/-小鼠体内将不会发生动脉粥样硬化性病变，而将Bmal1-/-小鼠的主动脉移植到野生型小鼠体内可以在移植的主动脉上发现明显的动脉粥样硬化斑块的形成〔14〕。本研究同样发现Bmal1和Clock mRNA表达在急性冠脉综合征患者中明显降低，且与冠脉狭窄程度呈负相关关系。

MMPs参与了斑块的形成和血管壁的重塑，在泡沫细胞丰富的区域，MMPs的浓度较高，这说明MMPs在动脉粥样硬化形成过程中发挥重要作用。研究发现，MMPs浓度升高会促进斑块的破裂〔15〕，此外，MMPs活性的增强会激活促炎因子的表达〔16〕。Ma等〔17〕发现在睡眠剥夺可以激活小鼠细胞外信号调节激酶(ERK)通路并且上调MMPs mRNA和蛋白水平。本研究也发现相比于冠脉正常女性患者，女性急性冠脉综合征患者中MMP2和MMP9的表达明显升高，与斑块的不稳定性密切相关。

综上，现代女性虽然较少有吸烟、高脂饮食等传统危险因素，但是在工作和家庭的双重压力下，易于出现失眠、熬夜、抑郁等导致昼夜节律紊乱的情况，这些往往得不到重视，导致女性急性冠脉综合征患者得不到及时规范的治疗〔18〕。女性患者昼夜节律紊乱会导致急性冠脉综合征的发生，并且与冠脉病变程度呈正相关关系。但是其潜在的作用机制尚不清楚，通过对其影响昼夜节律紊乱因素的调控及对其相关性针对治疗可以为女性急性冠脉综合征患者的预防治疗提供新的思路。