SFRP1基因沉默抑制人胃黏膜上皮GES-1细胞失巢凋亡

汤晓琳 杨丹 吕鑫 沈薇

(沈阳医学院 1机能实验中心，辽宁 沈阳 110034；2药理教研室；3 2018届临床医学专业；4病理生理教研室)

正常上皮细胞与细胞外基质(ECM)脱离黏附后，细胞与基质相互作用消失，发生失巢凋亡(anoikis)。肿瘤对失巢凋亡的抵抗能力在肿瘤转移中发挥重要作用。胃癌是全球常见的恶性肿瘤，预后较差，其5年生存率仅为20%～30%〔1〕，胃癌转移是导致死亡的最主要原因。研究表明，分泌型卷曲相关蛋白(SFRP)1在胃癌中呈低表达，且与淋巴结转移及患者不良预后相关〔2〕。有报道SFRP1甲基化致基因沉默促进胃癌的形成和发展〔3〕，但关于SFRP1对细胞失巢凋亡的影响及其机制尚少报道。本课题组在前期研究中发现胃黏膜上皮细胞(GES)-1为失巢凋亡敏感细胞〔4〕，本研究应用RNA干扰沉默GES-1中SFRP1表达，观察其对GES-1细胞失巢凋亡敏感性的影响，并探讨其相关分子机制。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂 人GES-1(武汉普诺赛公司)。RPMI1640培养基(美国Corning公司)；胎牛血清(美国Gemini公司)；胰蛋白酶-乙二胺四乙酸(EDTA)(天津灏洋生物有限公司)；SFRP1基因siRNA(上海吉玛基因公司)；脂质体Lipofectamine 2000(美国Invitrogen公司)；RNA提取试剂盒(美国Axygen公司)；逆转录试剂盒、Q-PCR试剂盒(美国Promega公司)；多聚α-羟乙基甲基丙烯酸酯(Poly-HEMA，美国Sigma公司)；凋亡检测试剂盒(日本同仁化学研究所)；CytoSelectTM24-Well Anoikis Assay(美国Cell Biolabs公司)。兔多克隆抗体SFRP1(美国Abcam公司)；鼠单克隆抗体β-catenin 抗体、β-actin抗体(美国Santa Cruz公司)；辣根过氧化物酶(HRP)标记山羊抗鼠和山羊抗兔IgG，增强化学发光(ECL)试剂盒(美国Proteintech公司)；红色荧光素(RRX)标记山羊抗兔IgG(中国康为世纪公司)；4′6-二脒基-乙-苯基吲哚(DAPI)染液、十二烷基硫酸钠(SDS)-聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)配制试剂盒(上海碧云天公司)。

1.2 方法

1.2.1 细胞培养及转染 GES-1培养在含有10%胎牛血清的RPMI1640培养基中，在37℃、5% CO2条件下培养。针对SFRP1不同位点的三组siRNA基因序列及对照组Control siRNA序列如下：siRNA-612正义：5′-GCUCAACAAGAACUGCCACTT-3′，反义：GUGGCAGUUCUUGUUGAGCTT-3′；siRNA-891正义：5′-GAAAUCUGAGGCCAUCAUUTT-3′，反义：5′-AAUGAUGGCCUCAGAUUUCTT-3′；siRNA-740正义：5′-UCAUGCAGUUCUUCGGCUUTT-3′，反义：5′-AAGCCGAAGAACUGCAUGATT-3′)；Control siRNA正义：5′-UUCUCCGAACGUGUCACGUTT-3′，反义：5′-ACGUGACACGUUCGGAGAATT-3′。转染前24 h，将(1.5～2.0)×105个/ml处于对数生长期的细胞铺于6孔板内，每孔1 ml，培养过夜。第2天用脂质体包埋的siRNA与细胞结合进行瞬时转染，操作严格按照说明书进行。48 h后使用胰酶消化收集各组细胞进行失巢培养。

1.2.2 失巢凋亡模型的建立 称取1 g Poly-HEMA，加入10 ml无水乙醇，震荡混匀，37℃水浴加热至无颗粒状态，浓度为10 mg/ml。取3 ml液体覆盖于培养皿(60 mm)底部，在超净台内吹干，室温下待乙醇挥发使其自然凝固，重复操作2次，使用前磷酸盐缓冲液(PBS)清洗3次。收集转染48 h后的细胞接种于Poly-HEMA包被的培养皿中，细胞在培养皿中非黏附生长而呈悬浮状态，置于37℃、5%CO2条件下培养24 h。

1.2.3 Realtime RT-PCR检测 处理后细胞提取总RNA，以Oligo dT为引物逆转录合成第一条cDNA链，然后以第一条cDNA链为模板进行PCR扩增。引物序列：SFRP1正义：5′-GATGCTTAAGTGTGACAAGTTCCC-3′，反义：5′-TGGCCTCAGATTTCAAC TCGT-3′；GAPDH正义：5′-GCACCGTCAGGCTGAGAA-3′，反义：5′-TGGTGAAGACGCCAGTGG-3′；Cyclin D1正义：5′-AACTACCTGGACCGCTTCCT-3′，反义：5′-CCACTTGAGCTTGTTCACCA-3′；c-Myc正义：5′-ACCAGATCCCGGAGTTGGAA-3′，反义：5′-CGTCGTTTCCGCAACAAGTC-3′。ABI 7500 Real-time PCR扩增仪进行操作，反应条件为95℃预变性10 min、95℃ 15 s、60℃ 1 min，共40个循环，添加溶解曲线，计算平均值，最后以2-ΔΔCt方法计算目的基因相对表达量，重复实验3次。

1.2.4 流式细胞术检测细胞失巢凋亡率 收集各组悬浮培养24 h后的细胞，Annexin Ⅴ-FITC/PI 双染及流式细胞术检测失巢凋亡率。PBS洗涤并收集细胞，加入1倍Annexin V上样缓冲液制成1×106个/ml的细胞悬液，取100 μl细胞悬液，加入5 μl Annexin V-FITC，5 μl碘化丙啶(PI)，室温下避光孵育15 min，加入上样缓冲液后上机检测。重复实验3次。

1.2.5 Calcein AM/EthD-1荧光双染法检测失巢凋亡 转染后各组悬浮培养24 h的细胞，每孔分别加入1 μl Calcein AM(500×)和1 μl EthD-1(500×)，37℃孵育30～60 min，荧光倒置显微镜下观察。Calcein AM呈绿色荧光，检测活细胞的存在。EthD-1呈红色荧光，检测失巢凋亡细胞的存在。应用Image J软件进行细胞荧光强度的测定及分析。

1.2.6 软琼脂集落培养实验 软琼脂培养皿分为两层，底层软琼脂浓度为0.5%，上层软琼脂浓度为0.3%。转染48 h后收集细胞，制成密度为10×104个/ml的细胞悬液，取100 μl铺于软琼脂覆盖的培养皿中，在37℃、5% CO2条件下孵育14 d，倒置显微镜下观察细胞集落的形态和数目，每组样品随机拍摄5个视野，统计集落数，重复实验3次。

1.2.7 细胞免疫荧光检测 失巢培养24 h后收集细胞悬液，稀释浓度至15×104个/ml，取1 ml悬液铺于共聚焦培养皿中，再加入1 ml培养基，37℃、5%CO2条件下培养过夜。第二天弃掉培养基，PBS洗涤2次，4%多聚甲醛固定30 min，弃掉甲醛用PBS漂洗；0.2%Triton室温30 min进行细胞透化；5%BSA封闭60 min后弃掉液体；一抗β-catenin(1∶200)孵育，4℃过夜。PBS漂洗3次，二抗红色荧光RRX标记IgG(1∶50)室温避光孵育45 min，洗去二抗，加入DAPI染核(200 μl/皿)，室温10 min，PBS漂洗后置于倒置荧光显微镜下拍照。

1.2.8 Western印迹检测 提取各组细胞总蛋白测量浓度并定量。一抗为SFRP1(1∶500)，β-catenin(1∶200)；β-actin (1∶1 000)。二抗为羊抗鼠IgG(1∶5 000)，羊抗兔IgG(1∶5 000)。10% SDS-PAGE电泳，电泳分离后将蛋白电湿转至硝酸纤维素膜(PVDF)上，5% 过滤脱脂奶封闭1 h，4℃一抗孵育过夜，TBST洗3遍，每次10 min。加入HRP标记的二抗，室温孵育1 h，TBST洗膜30 min，ECL发光显色。

1.3 统计学分析 应用SPSS23.0软件，两组间比较采用t检验，多组间比较采用单因素方差分析，组间两两比较采用LSD法。

2 结 果

2.1 SFRP1 siRNA转染对GES-1细胞SFRP1 mRNA和蛋白表达的影响 针对SFRP1不同位点的3组SFRP1 siRNA及对照组Control siRNA分别转染GES-1细胞。与对照组设为1比较，siRNA-612组(0.47±0.09)及siRNA-891组SFRP1 mRNA表达(0.31±0.13)均明显降低(P<0.01)。siRNA-740组sFRP1 mRNA相对表达量为0.89±0.09。Western印迹结果显示，siRNA-891组SFRP1蛋白表达水平明显降低(图1)。提示SFRP1 siRNA-891成功转染GES-1细胞，显著下调SFRP1基因和蛋白表达。后续实验选用siRNA-891进行。

2.2 降低SFRP1表达对GES-1细胞失巢凋亡的影响 流式细胞术结果显示，siRNA-891组细胞失巢凋亡率〔(13.80±2.66)%〕较对照组〔(27.85±5.25)%〕明显降低(P<0.05)。

Calcein AM/EthD-1荧光双染法检测发现，与对照组〔EthD-1:(21.98±9.18)%,Calcein AM:(11.63±0.68)%〕比较，siRNA-891组EthD-1红色荧光染色的失巢凋亡细胞数目〔(6.64±1.42)%〕明显减少，Calcein AM绿色荧光染色的存活细胞数目〔(32.10±7.88)%〕明显增多(图2)。Calcein AM和EthD-1荧光值分析显示，siRNA-891组较对照组有显著差异(P<0.05)。

图1 SFRP1 siRNA转染对GES-1细胞SFRP1蛋白表达的影响

图2 Calcein AM/EthD-1荧光双染法检测GES-1细胞失巢凋亡的变化(×20)

2.3 降低SFRP1表达对细胞非锚定生长的影响 siRNA-891组与对照组相比，细胞集落明显变大，细胞集落数量明显增多〔对照组(13.3±4.04)个，siRNA-891组(25.67±2.08)个，P<0.05〕。见图3。

图3 SFRP1 siRNA转染对GES-1细胞非锚定生长的影响(×20)

2.4 降低SFRP1表达对细胞内β-catenin蛋白定位及表达的影响 与对照组比较，siRNA-891组β-catenin在细胞核中表达明显增强。Western印迹结果显示，siRNA-891组β-catenin蛋白表达水平较对照组明显增加。上述结果提示，降低SFRP1表达后Wnt通路激活，其通路中关键因子β-catenin表达增加(图4)。

A:1,DAPI标记细胞核；2,β-catenin-RRX荧光标记；3,1和2的重叠影像;B:β-catenin蛋白表达结果图4 SFRP1 siRNA转染对GES-1细胞β-catenin蛋白表达及定位的影响(×20)

2.5 降低SFRP1表达对β-catenin靶基因c-Myc 和 CyclinD1表达的影响 与对照组(1.00±0.00)相比，siRNA-891组c-Myc mRNA(5.55±0.52)和CyclinD1 mRNA(2.48±0.22)表达明显增加，差异有统计学意义(P<0.01)。

3 讨 论

正常细胞依附ECM而存活称为锚定依赖。当正常上皮细胞与ECM失去黏附后，细胞与基质相互作用消失，发生失巢凋亡。这种特殊的细胞死亡形式对于维持机体组织结构至关重要。肿瘤细胞可在锚着不依赖的条件下存活，获得失巢凋亡抗性，进而发生迁移，侵入ECM，通过血液循环扩散到其他组织中增殖。因此，研究失巢凋亡的发生对揭示肿瘤转移的机制有重要意义。失巢凋亡与胃癌的关系近年来受到关注。有报道，促进肿瘤侵袭转移的基因DBC1，α-fetoprotein，Claudin-1可阻止胃癌细胞发生失巢凋亡〔5～7〕。但抑制肿瘤发展基因的表达与胃癌失巢凋亡的关系尚未见报道。

SFRPs 属于分泌型糖蛋白家族，约有300个氨基酸，称为分泌型卷曲相关蛋白。目前发现SFRP家族有7个成员，分别是SFRP1、SFRP2、SFRP3、SFRP4、SARP3、sizzled及crescent,其中SFRP1在多种恶性肿瘤组织中呈低表达或表达缺失。Zhang等〔2〕研究发现，SFRP1表达缺失存在于原发性胃癌，并且与SFRP1高甲基化密切相关。Cheng等〔3〕发现SFRP1的表达缺失促进胃癌发生淋巴转移。有报道人乳腺上皮细胞中SFRP1表达抑制促进细胞发生上皮间质转化，并获得局部浸润和迁移的特性〔8〕。肝癌细胞中过表达SFRP1可降低细胞的增殖力和迁移力〔9〕。但SFRP1表达沉默在肿瘤发生发展中的作用及机制仍不十分清楚，SFRP1基因对胃上皮细胞或胃癌细胞失巢凋亡的影响尚未见报道。本课题组在前期研究中报道了GES-1为失巢凋亡敏感细胞〔4〕，本研究结果提示抑制SFRP1基因表达后，GES-1细胞失巢凋亡敏感性下降，进而易获得失巢凋亡抵抗的能力。细胞的锚定不依赖性生长也可通过软琼脂集落实验检测。有报道软琼脂形成集落数目越多，细胞侵袭能力越强〔10〕。单个细胞集落形成状况反映了细胞抵抗失巢凋亡能力的高低〔11〕。本研究发现转染SFRP1siRNA抑制SFRP1表达后，GES-1细胞集落形成数目显著增多。上述结果证实抑制SFRP1基因表达使正常胃黏膜上皮细胞失巢凋亡敏感性显著下降，SFRP1的表达对于维持胃黏膜上皮细胞失巢凋亡特性具有重要作用，提示胃癌中SFRP1表达缺失可能参与介导细胞获得失巢凋亡抗性。

Wnt信号通路在细胞增殖、分化和凋亡中起重要作用，蛋白通过自分泌或旁分泌作用与位于细胞膜上的Fz受体结合，通过其下游蛋白的磷酸化与去磷酸化过程来完成Wnt信号途径的传递。Wnt通路的异常活化与肿瘤形成密切相关，影响肿瘤的侵袭转移〔12，13〕。有研究发现，胰腺癌细胞中Wnt2的异常表达抑制细胞的失巢凋亡，在体内促进肿瘤转移的发生〔14〕。SFRP1基因结构与Fz受体相似度可达30%～50%，具有同源的配体抑制区，故SFRP1可竞争性抑制Fz受体，阻止Wnt与Fz结合或与Fz结合但形成无功能复合物，从而阻断Wnt通路激活〔15，16〕。

Wnt通路激活时，胞质中的β-catenin不被降解并持续活化，在细胞核中积聚，在细胞失巢凋亡抵抗中发挥重要作用〔17〕。Cho等〔18〕研究发现，肺癌细胞中抑制SFRP1表达后，Wnt通路被激活，β-catenin表达增高。Gauger等〔8〕在乳腺上皮细胞中抑制SFRP1表达，发现β-catenin表达增高，从细胞质移位到细胞核并积聚。本研究得出相似的结果，发现失巢培养的GES-1中抑制SFRP1表达后，细胞核中β-catenin表达明显增多，β-catenin蛋白表达升高；抑制SFRP1表达后，c-Myc和cyclin-D1基因表达显著增高。Dai等〔19〕报道沉默c-Myc表达促进牙周韧带细胞发生失巢凋亡。Jiang等〔9〕发现肝癌细胞中过表达SFRP1可降低CyclinD1表达，抑制细胞侵袭转移。提示β-catenin的靶基因c-Myc和CyclinD1参与细胞失巢凋亡的调控，与本研究结果一致。

综上所述，本研究首次发现抑制SFRP1基因表达可降低EGS-1对失巢凋亡的敏感性，激活Wnt通路，β-catenin及其靶基因表达增高可能是其作用机制。本研究为SFRP1在胃癌发展中的作用及机制研究提供了新的思路和理论依据，提示SFRP1表达沉默诱导正常细胞获得失巢凋亡抵抗的能力。