F10基因遗传多态性与缺血性脑卒中痰瘀证及冠心病痰瘀证凝血标志物的相关性

古联 李敏华 李金鸿 梁宝云 黄思芸 苏莉

(1广西中医药大学第一附属医院脑病科，广西 南宁 530023；2广西中医药大学；3广西医科大学公共卫生学院)

《金贵要略·中风历节病脉证并治》说道：“正气引邪，喎僻不遂。邪在于络，肌肤不仁；邪在于经，即重不胜，邪入于腑，即不识人；邪入于脏，舌即难言，口吐涎。”《素问·痹论》有云：“心痹者，脉不通，烦则心下鼓，暴上气而喘。”中医学对缺血性脑卒中(IS)及冠心病(CAD)都有详尽的描述；现代研究发现，缺血性心脑血管疾病的发病与基因遗传多态性有关。F10〔即凝血因子Ⅹ(FⅩ)〕是一种血浆糖蛋白，其活性形式(FⅩa) 在血液凝固的反应中起关键性作用。FⅩa可诱导凝血酶的产生，并刺激内皮细胞和平滑肌细胞分裂〔1〕。FⅩ活性增加代表潜在的高凝状态，可使动脉粥样硬化血栓并发症的发生风险增高〔2〕，而脑梗死、冠心病患者的血液长期处于高凝状态〔3〕。因此，F10可能参与了心脑血管疾病中IS及CAD的发生与发展过程。本研究旨在探讨F10基因多态性与IS痰瘀证及CAD痰瘀证中凝血标志物的关联性。

1 资料与方法

1.1 对象

1.1.1 一般资料 IS、CAD病例来源于2015年1月至2017年12月在广西中医药大学第一附属医院脑病科及心血管科住院治疗的患者。IS痰瘀证550例(男306例、女244例)，平均年龄(70.10±8.82)岁；CAD痰瘀证550例(男316例、女234例)，平均年龄(70.07±10.95)岁。对照组样本源于同期在该院健康体检中心的健康体检人群及骨科病情轻微的外伤住院病人，且性别、年龄分布均与病例组相匹配。对照组550例(男293例，女257例)，平均年龄(69.23±9.68)岁。三组间性别、年龄分布上的差异均无统计学意义(P>0.050)。纳入的1 650例研究对象均为相互之间无血缘关系的中国汉族人，并签署知情同意书。

1.1.2 诊断标准及中医辨证分型标准 IS的西医诊断符合中华医学会第四次全国脑血管病学术会议修订的《各类脑血管疾病诊断要点》；中医诊断遵循1996年国家中医药管理局全国脑病急症科研协作组制订的《中风病诊断疗效评定标准(试行)》，所有IS患者均经头颅CT和(或)磁共振成像(MRI)确诊。CAD纳入的西医诊断标准参照国际心脏病学会和协会及WHO临床命名标准化专题组联合报告《缺血性心脏病的命名及诊断标准》；中医诊断采用中国1990年中西医结合学会心血管学会修订的《冠心病中医辨证标准》；纳入的CAD患者均经冠状动脉造影、血清心肌酶、心电图等检查确诊。IS痰瘀证及CAD痰瘀证患者的中医辨证分型需满足“心脑血管病痰证的宏观辨证标准”〔4〕和第二届全国活血化瘀研究学术会议修订的《血瘀证诊断标准》〔5〕。

1.1.3 排除标准 排除由动脉炎、肿瘤、血液病、脑外伤、脑血管畸形、药物等引起的脑卒中、严重瓣膜性心脏病、恶性心律失常反复发作及纽约心脏病协会(NYHA)分级心功能Ⅳ级等急危重症者，及合并严重免疫系统或感染性疾病者，年龄低于40岁或超过80岁者。对照组中有心脑血管疾病家族史的患者或因精神、语言等因素无法合作完成资料收集者不纳入此次研究。

1.2 方法

1.2.1 基因分型 用加入乙二胺四乙酸(EDTA)的抗凝管采集参与者清晨空腹血2 ml，使用全血基因组DNA提取试剂盒〔北京艾德莱生物科技有限公司(Aidlab biotechnologies CO.Ltd)〕，按照试剂说明书提供的操作步骤提取血液基因组DNA，采用1.25%的琼脂糖凝胶电泳对DNA进行质检，合格即放至-80℃冰箱冻存备用。通过Agena平台，采用MassARRAY SNP基因分型实验技术，对F10基因rs3093261、rs563964多态性位点的基因分型进行检测。采用 AssayDesigner3.1 软件进行引物设计，其中位点rs3093261第一引物序列为：ACGTTGGATGCGTTGGCATCCAGCATCATC，第二引物序列为：ACGTTGGATGAGCCTGGTGTGCACACATTG。位点rs563964 第一引物序列为：ACGTTGGATGTGGGAACACATCCACTCT GG，第二引物序列为：ACGTTGGATGAGAACAGAAAGTCCCCACAC。

1.2.2 基因表达水平检测 用EDTA抗凝管采集研究对象空腹外周静脉血5 ml，采用TRIzol法，通过TRIzolTMReagent (InvitrogenTM)试剂提取血清总RNA。使用PrimeScriptTMRT reagent Kit with gDNA Eraser(TaKaRa)及T100TMThermal Cycler(BIO-RAD)对血清总RNA进行逆转录合成cDNA。F10基因碱基序列需从NCBI中的GenBank上查找，委托宝生物工程(大连)有限公司完成引物设计及合成。以GAPDH为内参，上游引物为5′-AGTCCTTCCACGATACCAAAGT-3′，下游引物为5′-CATGAGAAGTATGACAACAGCCT-3′。目的基因F10，上游引物序列为：5′-GCCAGAACCAGGG CAAATGTA-3′，下游引物序列为：5′-CCGTTGTCAGCCAGGGTGTA-3′。F10基因mRNA表达水平的测定通过qRT-PCR技术，使用Applied Biosystems 7500 Fast型荧光定量PCR仪及SYBR®Premix Ex TaqTMⅡ(TaKaRa)试剂盒进行。反应条件：95℃ 30 s，95℃ 5 s，60℃ 34 s，40个循环。各F10 mRNA表达水平比较用相对表达量2-△△ct计算。

1.2.3 凝血标志物的测定 采集研究对象空腹血2 ml，采用凝固法通过法国StAgO Capact血凝仪检测血浆中凝血功能指标，包括活化部分凝血酶原时间(APTT)、D二聚体(D-D)、纤维蛋白原(FIB)、国际标准化比率(INR)、凝血酶原时间(PT)、凝血酶原时间活动度(PTA)、凝血酶时间(TT)。采用电阻抗法，通过迈瑞6900全自动血细胞分析仪检测全血中血小板(PLT)的水平。

1.3 统计方法 采用PLINK对基因型与表型进行遗传关联分析。基因型频率分布的哈温平衡(HWE)通过拟和优度χ2检验进行分析。应用非条件Logistic回归模型对各遗传模型(加性模型、显性模型、隐性模型)与疾病的关联进行分析，通过比值比(OR)及 95%置信区间(CI)表示其关联强度。多态性位点与数量性状的相关性分析使用一般线性模型。采用SPSS16.0软件进行其他计数资料的χ2检验。

2 结 果

2.1 F10基因mRNA表达水平比较 IS痰瘀证F10基因mRNA表达水平(0.855±0.307)显著高于对照组(0.249±0.156，P<0.001)；CAD痰瘀证组F10基因mRNA表达水平(0.735±1.247)亦显著高于对照组(0.249±0.156，P=0.003)。

2.2 F10基因多态性的基因型分布与HWE检验 F10基因多态性rs3093261(P=0.180)、rs563964(P=1.000)位点的基因型在对照组中的分布均符合HWE。IS痰瘀证组与对照组及CAD痰瘀证组与对照组之间的rs3093261基因型频率分布差异均无统计学意义(χ2=1.218，P=0.544；χ2=1.173，P=0.556)。rs563964位点的基因型频率在IS痰瘀证组与对照组及CAD痰瘀证组与对照组之间的分布差异均无统计学意义(χ2=0.634，P=0.728；χ2=0.570，P=0.752)。见表1。

2.3 F10基因多态性与IS痰瘀证、CAD痰瘀证发病风险的关联分析 在各个遗传模型中，F10基因rs3093261、rs563964多态性与IS痰瘀证发生风险的关联分析均无统计学差异(均P>0.05)，位点rs3093261、rs563964与CAD痰瘀证发生风险的关联亦均未发现有统计学差异(均P>0.05)。见表2。

2.4 F10基因多态性与IS痰瘀证凝血标志物的分析 F10基因rs3093261多态性与IS痰瘀证组的APTT水平显著相关 〔隐性模型：βadj(95%CI)= 1.09(0.74～1.59)，Padj=0.022〕，但位点rs563964与IS痰瘀证患者凝血标志物各项指标的相关性均无统计学差异(均P>0.05)。见表3。

2.5 F10基因多态性与CAD痰瘀证凝血标志物的分析 F10基因rs563964多态性与CAD痰瘀证患者的PLT水平的相关性具有统计学意义(加性模型：βadj(95%CI)= -14.97(-26.68～-3.26)，Padj=0.013；显性模型：βadj(95%CI)= -16.45(-29.77～-3.13)，Padj=0.016)，而F10基因中rs3093261位点与CAD痰瘀证患者凝血标志物相关指标的相关性均无统计学意义(均P>0.05)。见表4。

表1 三组F10基因rs3093261、rs563964位点基因型频率分布比较及HWE检验(n)

A1：小等位基因；A2：大等位基因；PHWE为对照组的HWE检验P值；1)有1例基因分型失败

表2 F10基因rs3093261、rs563964多态性与IS痰瘀证、CAD痰瘀证发生风险的关联分析

表3 F10基因rs3093261、rs563964多态性与IS痰瘀证凝血标志物的关联分析

βa：未进行校正；βb：根据年龄、性别进行校正；Padj：根据年龄、性别进行校正；下表同

表4 F10基因rs3093261、rs563964多态性与CAD痰瘀证凝血标志物的关联分析

3 讨 论

关于IS及CAD，在《本草新编》中提到：“中风未有不成痰瘀者也。”而在《证因脉治》中则提到：“心痹之因痰凝血滞。”痰和瘀在IS痰瘀证及CAD痰瘀证中既是病理产物，同时也作为致病因素存在，痰、瘀二者在一定的条件下可以相互转化、合而致病。杨利等〔6〕研究发现，瘀血和痰浊在IS的发病中有着重要作用，且存在于IS发展的整个过程。现代研究〔7〕认为，血液中脂质沉着为痰浊存在的表现，而微循环功能障碍中血细胞的黏附相当于中医学所说的瘀血；痰、瘀的相互结合可致使血管内皮受到损伤，进而导致IS和(或)CAD的发生发展。

本研究结果说明F10基因可能同时影响IS痰瘀证、CAD痰瘀证的发病机制。FⅩ作为一种血浆糖蛋白，在凝血级联中起着关键作用，凝血级联是凝血酶形成共同途径中的第一种酶。组织因子通过与激活FⅩ的激活因子Ⅶ(FⅦa)形成复合物来启动凝血级联反应。FⅩa与其活化的辅因子Ⅴa因子(FⅤa)的结合导致凝血酶、纤维蛋白形成和血小板生成的激活〔8〕。血小板的活化影响了痰瘀证的发生发展过程，高血压作为IS及CAD的共同危险因素，高血压痰瘀证的发展过程实际上就是一个PLT激活程度增强、促进聚集和血栓形成的过程〔9〕。F10可能通过激活FⅩa间接影响了IS痰瘀证、CAD痰瘀证的发生发展，提示F10基因表达参与了IS痰瘀证及CAD痰瘀证的临床病理过程。

本研究发现F10基因rs3093261多态性与IS痰瘀证患者的APTT水平显著相关，提示F10 基因多态性可能影响IS痰瘀证患者的凝血功能。潘学谊等〔10〕认为血液黏稠度的增加是导致IS患者脑梗死的重要原因，血液处于高凝状态时，血管内血栓形成增加了血管堵塞风险。在凝血途径中，FⅩ既可以被内源性凝血途径FⅨa/FⅧa 激活，又可以被外源性凝血途径 FⅦa/TF激活，转化为活性形式FⅩa。FⅩa是共同凝血途径中的关键酶，通过激活凝血酶原转变为凝血酶，从而促进凝血酶的生成〔11〕。FⅩa不仅在凝血级联反应中发挥重要作用，而且在许多细胞类型如内皮细胞、血小板、成纤维细胞和平滑肌细胞中通过蛋白酶活化受体发挥促炎反应作用〔12～14〕。APTT的水平在一定程度上反映了内源性凝血途径的状况，降低则见于高凝状态〔15〕。本研究中位点rs3093261多态性与IS痰瘀证患者的APTT水平有关提示在临床上F10 基因多态性可作为IS痰瘀证APTT水平的潜在干预靶点。

本研究发现，F10基因rs563964多态性与CAD痰瘀证患者的PLT水平在加性模型、显性模型中均有显著相关性，提示F10基因多态性可能影响CAD痰瘀证患者的凝血功能。早期研究表明，PLT参数在血栓性疾病的诊断中具有重要的临床意义〔16〕，包括PLT在内的血液高凝状态为心血管疾病的发生提供了基础〔17〕。在先前流行病学研究中，高血浆FⅩ水平是冠状动脉疾病或复发性心肌梗死的主要危险因素，主要与高三酰甘油血症相关〔18，19〕。在动脉粥样硬化和CAD的发生发展中，血栓的形成发挥了重要的作用，并与凝血机制密切相关〔20〕。凝血酶与PLT受体结合促进PLT释放血管内皮生长因子，还可与单核细胞受体结合通过释放各种炎症细胞因子参与组织损伤和血管再生〔21〕。

总之，F10基因表达水平可能同时影响IS痰瘀证、CAD痰瘀证的发生，提示F10基因mRNA表达可作为IS痰瘀证、CAD痰瘀证的候选治疗靶点；另外，F10基因遗传多态性可能对IS痰瘀证、CAD痰瘀证的凝血功能都有影响。