老年高危型人乳头瘤状病毒感染后宫颈微环境中细胞因子变化

赵书利 李晨 兰露莎 刘雨思 杨红宇 何志旭 舒莉萍

(1贵州医科大学组织工程与干细胞实验中心 贵州医科大学基础医学院免疫学教研室 中国医学科学院成体干细胞转化研究重点实验室 贵州医科大学实验动物中心，贵州 贵阳 550004;2贵阳市妇幼保健院；3大连医科大学基础医学院)

宫颈癌的发病率及死亡率均占我国女性生殖系统恶性肿瘤的首位，严重威胁女性的身心健康〔1,2〕。同各种恶性肿瘤的发病年龄相似，宫颈癌的主要受累人群以老年人群为主。流行病学研究表明，宫颈癌的发生、发展和人乳头瘤状病毒(HPV)的感染密不可分，尤其是高危型HPV(HR-HPV)的持续感染〔3,4〕。随着HPV预防性疫苗的上市及宫颈癌筛查手段的不断更新普及，目前我国宫颈癌的发病率及死亡率已有所降低〔5,6〕。据报道女性一生有70%～80%概率感染HPV，但大多数人会依靠自身免疫将病毒清除，并不会发展至宫颈上皮内瘤变或宫颈癌，因此早期预判宫颈病变的发展方向并采取正确治疗措施尤为重要〔7〕。但目前我国宫颈癌筛查项目只能单一时间节点判断病变程度，尚不能早期预测疾病的发展，且花费高、痛苦大。研究表明，HR-HPV持续性感染可造成宫颈局部白细胞介素(IL)-2、IL-4等免疫炎性因子的变化，使辅助性T细胞(Th)中的Th1型/Th2平衡失调，辅助HR-HPV感染细胞免疫逃避，使病变持续发展〔8〕。本研究拟通过宫颈局部微环境中免疫炎性因子水平的变化对老年女性HR-HPV持续感染后疾病发生发展方向进行预测。

1 资料与方法

1.1 一般资料 选取2017年1月至2018年6月就诊于贵阳市妇幼保健院行门诊阴道镜检查HR-HPV感染的老年女性患者150例，根据病理活检结果分为无宫颈上皮内病变(NSIL)组、低级别宫颈上皮内病变(LSIL)组和高级别宫颈上皮内病变(HSIL)组各50例。纳入标准：①年龄>60岁；②有性生活史；③有完整子宫。排除标准：①急性生殖道炎症；②3 d内有性生活及阴道给药；③非宫颈组织恶性肿瘤；④半年内使用免疫抑制剂或免疫调节剂等。3组一般资料比较均无统计学差异(P>0.05)，见表1。

表1 3组一般资料比较

1.2 标本采集 标本采集均经患者及其家属同意。患者取膀胱截石位，窥阴器打开阴道，无菌注射器抽取5 ml生理盐水冲洗宫颈及阴道上1/3，保留10 s后于后穹窿处抽取3～4 ml，室温状态下以2 000 r/min离心5 min，保留上清液于-80℃，备炎性因子的检测。宫颈刷收集脱落细胞保存于4℃，用于DNA的检测及HPV分型。上述标本收集后取宫颈组织固定于甲醛溶液中用于病理检测分组，观察无出血后取出窥阴器结束标本收集。

1.3 细胞因子的检测 使用BD CBA人细胞因子Th1/Th2/Th17试剂盒(美国BD公司)检测IL-2、IL-4、IL-6、IL-10、肿瘤坏死因子(TNF)、干扰素(IFN)-γ、IL-17A。人转化生长因子(TGF)-β采用酶联免疫吸附试验试剂盒(德国IBL公司)检测。用巢式聚合酶链式反应及焦磷酸测序法对HPV阳性样本进行分型检测。

1.4 统计学方法 使用SPSS23.0软件进行单因素方差分析、LSD-t检验、χ2检验。

2 结 果

2.1 各组细胞因子的比较 IL-2含量随宫颈病变分级增加而逐渐降低，各组间比较具有显著差异(P<0.01)；IL-6含量随宫颈病变分级增加而逐渐升高，各组间比较具有显著差异(P<0.01)；其余6种细胞因子含量随宫颈病变分级增加无显著变化(P>0.05)。见表2。

表2 各组细胞因子比较

与NSIL组比较:1)P<0.001；与LSIL组比较:2)P<0.001

2.2 各组HPV感染分型的比较 只针对HR-HPV进行分型检测，以HPV16单独感染最常见〔65例(43.3%)〕，其次为其他HR-HPV混合感染〔59例(39.4%)〕，而包含HPV16型的混合感染最为少见〔26例(17.3%)〕。3组HPV感染分型总体比较差异无统计学意义(χ2=2.68，P=0.16)。见表3。

2.3 HPV亚型间细胞因比较 HPV亚型间各细胞因子比较差异均无统计学意义(P>0.05)。见表4。

表3 各组感染HPV类型情况〔n(%)，n=50〕

表4 HPV亚型间细胞因子水平的比较

3 讨 论

世界范围内每年新发宫颈癌患者约50万例，其中约半数患者死亡，宫颈癌已成为继乳腺癌后的第二大女性健康杀手〔9〕。HPV为双链环状DNA病毒，具有较强的宿主特异性及组织特异性，能够引起人体皮肤黏膜细胞的增殖，从而引发癌变〔10,11〕。根据HPV致病力强弱又可将其分为低危型和高危型，HR-HPV包括HPV16、HPV18、HPV58等型，其与女性的宫颈癌、男性阴茎癌及头颈部鳞状细胞癌等密切相关。HR-HPV持续性感染造成宫颈局部微环境中免疫炎性因子如IL-2、IL-6及IFN-γ等变化，使得Th1/Th2平衡漂移，即Th1因子劣势发展而Th2因子优势发展，削弱自身免疫对肿瘤细胞发展的抑制作用，从而使病毒感染持续存在及病变进一步发展。相关研究表明，随着宫颈病变分级的增加，Th1向Th2漂移程度越明显，因而Th1/Th2漂移程度可侧面反映疾病发展程度，可用于监视病情进展〔12〕。目前我国宫颈癌筛查流程复杂且花费较高，并不能监测宫颈病变的发展方向，可能延误疾病最佳治疗时机。老年患者体内雌激素水平下降，机体抵抗力降低，更易受HPV病毒感染，且老年患者健康检查意识薄弱，常常发现疾病时已至病程晚期〔13〕。

Th细胞在适应性免疫应答过程中发挥重要作用，Th1相关细胞因子包括IL-2、IFN-γ、TNF等，主要参与细胞免疫，用以抵抗宫颈细胞病毒的侵袭；Th2相关细胞因子包括IL-4、IL-6、IL-10 等，具有抑制机体免疫杀灭肿瘤细胞的作用；Th17细胞主要分泌IL-17，包括IL-17A～17E，其中IL-17A主要发挥肿瘤免疫作用，而TGF-β在Th17细胞与T细胞调节细胞(Treg)的平衡作用中发挥重要作用。正常情况下，Th1/Th2、Treg/Th17 处于动态平衡，维持机体的正常免疫功能。本研究说明Th1细胞因子降低，而Th2细胞因子升高，随着病变分级的增加Th1/Th2发生漂移的程度增加，机体免疫调节失去平衡，更利于肿瘤细胞的生长；而其余6种细胞因子组间差异无统计学意义，可能与IL-2和IL-6炎性因子对疾病的变化较为敏感，检测灵敏度较高有关。HR-HPV分型检测结果较为符合我国宫颈HPV病毒感染总体分布情况，且各亚型感染人数总体不具有统计学差异，并不会干扰各组中细胞因子的检测。在亚组分型中感染不同HPV类型的患者中，被检测的8种细胞因子均不具有统计学差异，进一步说明不同HR-HPV类型不会对细胞因子产生影响。但本研究为单中心、小样本研究，尚需多中心、大样本研究加以验证。

综上，老年女性HR-HPV感染后宫颈微环境中细胞因子的变化与肿瘤细胞生长有关，定期检测可以预测宫颈疾病的发展方向。