LncRNA NEAT1靶向miR-520b调控口腔鳞癌细胞增殖、凋亡及自噬的分子机制

王斌 吕锦 孔敏 王虎

(1成都市第一人民医院口腔科，四川 成都 610041；2四川大学华西口腔医院放射科)

非编码RNA约占人类基因组的98%，其中包括长链非编码RNA(LncRNA)和短链非编码RNA(miRNA)〔1〕。LncRNA为长度在200个核苷酸以上的非编码RNA，miRNA的长度在19～25个核苷酸，两者均可通过转录、转录后水平及表观遗传调控基因的表达，进而参与人类多种疾病的发生发展〔2〕。自噬为真核细胞的自身降解过程，与机体衰老、神经退行性疾病、肥胖及癌症均具有密切关系〔3〕。大量研究证实，自噬在肿瘤中具有双重作用，在肿瘤的不同阶段发挥不同作用。非编码RNA核富集的转录物(NEAT)1为新发现的一种Lnc RNA〔4〕，在口腔鳞癌中的作用机制尚未完全清楚。miRNA(miR)-520b在不同癌症中发挥不同作用〔5，6〕，其在口腔鳞癌中的作用尚未完全清楚。本研究拟以口腔鳞癌细胞Tca8113为研究对象，观察抑制NEAT1、过表达miR-520b、抑制miR-520b对Tca8113细胞增殖、凋亡和自噬的影响，为口腔鳞癌的治疗提供新靶点。

1 材料与方法

1.1 材料 人口腔鳞癌细胞Tca8113、人正常口腔上皮细胞HOEC，均购自美国菌种保存中心(ATCC)；达尔伯克改良伊格尔(DMEM)培养基、胎牛血清、四唑盐(MTT)、胰蛋白酶，均购自美国GIBCO公司；LipofectamineTM2000、二喹啉甲酸(BCA)蛋白定量试剂盒、逆转录试剂盒，购自大连Takara公司；聚偏二氟乙烯(PVDF)膜购自德国罗氏诊断有限公司；十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)试剂盒、电化学发光(ECL)发光液和RIPA蛋白裂解液，均购自碧云天生物技术公司；双荧光素酶报告基因检测试剂盒，购自美国Promega公司；Annexin V-FITC/PI凋亡检测试剂盒购自北京索莱宝公司。

1.2 方法

1.2.1 细胞培养 用含10%胎牛血清的DMEM培养基培养Tca8113、HOEC，置于37℃、5% CO2的培养箱中常规培养。

1.2.2 细胞转染 将si-NC、si-NEAT1、miR-520b mimics、miR-NC、si-NEAT1+anti-miR-NC、si-NEAT1+anti-miR-520b按照脂质体LipofectamineTM2000说明书操作步骤要求转染至Tca8113细胞，分别标记为si-NC组、si-NEAT1组、miR-520b组、miR-NC组、si-NEAT1+anti-miR-NC组、si-NEAT1+anti-miR-520b组，转染48 h后，采用qRT-PCR实验检测转染效率。转染成功后，用于后续试验。

1.2.3 qRT-PCR实验 取适量对数生长期1.2.2各组细胞，遵照RNA抽提试剂盒说明书要求提取RNA，进行定量，然后应用逆转录试剂盒按照说明书操作合成cDNA。最后按照qRT-PCR试剂盒说明书检测miR-520b、NEAT1。用2-△△Ct计算miR-520b、NEAT1的表达水平。

1.2.4 MTT实验 取适量1.2.2各组细胞，加入5 g/L的MTT溶液20 μl，培养4 h，然后弃去上清，每孔加入150 μl DMSO，震荡，使结晶溶解，在490 nm波长下检测细胞吸光度(A)。细胞的增殖力与细胞活力呈正比。

1.2.5 Annexin V-FITC/PI流式细胞术实验 取适量1.2.2各转染组细胞，用结合缓冲液500 μl悬浮细胞，分别加入5 μl的 Annexin V-FITC和PI，混匀，室温避光静置15 min。采用流式细胞仪分析结果。细胞的凋亡率(%)= 早期凋亡率+晚期凋亡率。每个样品重复3次。

1.2.6 Western印迹实验 收集1.2.2各组细胞，加入裂解液，冰上裂解30 min。12 000 r/min离心10 min，。取上清置于EP管，加入5倍SDS上样缓冲液，沸水煮沸10 min。电泳后用转膜仪将蛋白转移至PVDF膜；5%脱脂奶粉将膜封闭2 h，洗膜，加入一抗，4℃过夜孵育，洗膜，加二抗，4℃ 2 h。加发光液，曝光。

1.2.7 双荧光素酶报告基因检测实验 取适量对数生长期1.2.2各组细胞，遵照双荧光素酶报告基因检测试剂盒技术手册要求操作。psiCHECK2载体以萤火虫荧光素酶活性为内参，psiCHECK2-NEAT1-3′UTR WT和psiCHECK2-NEAT1-3′UTR MUT的表达为对照，转染24 h后，检测荧光强度。海参荧光素酶的发光强度与萤火虫荧光素酶发光强度的比值即反映miR-520b与NEAT1的结合力。

1.3 统计学处理 采用SPSS21.0软件，计量资料多组间比较采用单因素方差分析，两两比较采用SNK-

q检验。

2 结 果

2.1 NEAT1和miR-520b在人口腔鳞癌细胞Tca8113中的表达 与HOEC组相比，Tca8113组细胞中NEAT1表达显著升高，miR-520b表达显著降低(P<0.05)。见表1。

表1 NEAT1和miR-520b在Tca8113细胞和HOEC细胞中的表达

2.2 抑制NEAT1对Tca8113细胞增殖、凋亡的影响 与si-NC组相比，si-NEAT1组Tca8113细胞中NEAT1表达显著降低，48、72 h时细胞活性显著降低，细胞凋亡率显著升高(P<0.05)。见表2。

表2 抑制NEAT1表达对Tca8113细胞增殖和凋亡的影响

2.3 抑制NEAT1表达对Tca8113细胞自噬的影响 与si-NC组(0.36±0.04)相比，si-NEAT1组Tca8113细胞中LC3Ⅱ/Ⅰ蛋白表达量(1.07±0.08)显著升高(t=13.749，P=0.000)。见图1。

2.4 过表达miR-520b对Tca8113细胞增殖、凋亡和自噬的影响 与miR-NC组相比，miR-520b组Tca8113细胞中miR-520b表达显著升高，48、72 h时细胞活性显著降低，细胞凋亡率显著升高，LC3Ⅱ/Ⅰ蛋白表达量显著升高(P<0.05)。见表3，图2。

图1 抑制NEAT1表达对Tca8113细胞自噬相关蛋白LC3Ⅰ、Ⅱ表达的影响

表3 过表达miR-520b对Tca8113细胞增殖、凋亡和自噬的影响

图2 过表达miR-520b对Tca8113细胞LC3Ⅱ、Ⅰ表达的影响

2.5 NEAT1靶向miR-520b 运用miRcode数据库预测到miR-520b与NEAT1 3′UTR存在结合位点(图3)；双荧光素酶活性检测结果显示，与miR-NC组相比，miR-520b组WT-NEAT1细胞中荧光活性显著降低(miR-NC组：1.02±0.08，miR-520b组：0.41±0.05；t=11.199，P=0.000)，MUT-NEAT1细胞中荧光活性不受影响(miR-NC组：1.04±0.07，miR-520b组：0.98±0.09；t=0.912，P=0.414)。与pcDNA组(0.45±0.04)比较，pcDNA-NEAT1组miR-520b水平(0.21±0.03)显著降低(P<0.05)；与si-NC组(0.42±0.05)比较，si-NEAT1组miR-52b水平(1.04±0.06)显著升高(P<0.05)。

2.6 抑制miR-520b和抑制NEAT1对Tca8113细

胞增殖、凋亡和自噬的影响 与si-NEAT1+anti-miR-NC组相比，si-NEAT1+anti-miR-520b组Tca8113细胞在48、72 h细胞活性显著升高，细胞凋亡率显著降低，LC3Ⅱ/Ⅰ蛋白表达量显著降低(P<0.05)。见图4，表4。

图3 NEAT1的3′UTR中含有与miR-520b互补的核苷酸序列

1～4分别为：si-NC；si-NEAT1；si-NEAT1+anti-miR-NC；si-NEAT1+anti-miR-520b图4 LC3Ⅰ、LC3Ⅱ蛋白表达

表4 抑制miR-520b和抑制NEAT1对口腔鳞癌Tca8113细胞增殖、凋亡和自噬的影响

3 讨 论

NEAT1在许多人类癌症中起关键作用〔7，8〕，与机体多种疾病的发生发展密切相关〔9〕。大量研究证实，自噬在人类的多种肿瘤中存在异常，发挥抑制或促进肿瘤的作用〔10～12〕。Liu等〔13〕在口腔鳞状细胞癌中的研究发现，与邻近的非肿瘤组织和正常口腔角质形成细胞相比，鳞癌组织和细胞系中NEAT1的表达显著升高，且与患者的晚期临床分期和较短的存活时间显著相关，抑制NEAT1表达导致鳞癌细胞迁移和侵袭显著减少，伴随着基质金属蛋白酶(MMP)-2和MMP-9蛋白表达的减少，miR-365的抑制消除了敲低NEAT1对鳞癌细胞迁移和侵袭的抑制作用，提示NEAT1通过抑制miR-365促进OSCC细胞的迁移和侵袭，NEAT1可能为治疗鳞癌的潜在靶点。Huang等〔14〕研究发现，NEAT1在口腔鳞状细胞癌中表达异常升高，且可负向调控低表达的miR-365，敲除NEAT1可抑制细胞增殖和侵袭并诱导细胞周期停滞在G0/G1期和细胞凋亡，而抑制miR-365消除了敲低NEAT1对细胞过程的抑制作用，且 RGS20是miR-365的直接靶标，可通过增强细胞活力和运动性逆转过表达miR-365的肿瘤抑制作用，此外，RGS20、细胞周期蛋白D1、E-钙黏蛋白、N-钙黏蛋白和波形蛋白的表达可通过NEAT1/miR-365通路调节，沉默NEAT1也可抑制体内肿瘤生长，揭示了NEAT1/miR-365/RGS20通路可能是OSCC治疗的新策略。本研究结果发现，Tca8113细胞中NEAT1表达显著升高，且抑制NEAT1可抑制Tca8113细胞增殖、促进凋亡，这与Liu等〔13〕、Huang等〔14〕的研究结果相一致；进一步研究发现，抑制NEAT1能促进Tca8113细胞的自噬。

miRNA失调或功能障碍会促进或抑制癌症的发展〔15，16〕。miR-520b在多种肿瘤中表达异常，其在卵巢癌中发挥促癌作用〔17〕，在膀胱癌中发挥抑癌作用〔18〕。梁雪〔19〕研究发现，miR-520b可促进食管鳞癌细胞和乳腺癌细胞的自噬，且过表达miR-520b可抑制肿瘤细胞的增殖、迁移和侵袭。Jin等〔20〕发现，miR-520b过表达明显抑制了体外肺癌细胞增殖，抑制miR-520b能够加速肺癌细胞的增殖，敲低HDAC4逆转了抑制miR-520b诱导的细胞增殖，且在临床人肺癌样品中观察到miR-520b和HDAC4之间的负相关，提示MiR-520b降低HDAC4表达以控制肺癌细胞的增殖。Cui等〔21〕发现miR-520b在胶质瘤组织和细胞中低表达，且miR-520b可抑制胶质瘤细胞的葡萄糖代谢、侵袭、血管生成和化学敏感性，其机制与直接靶向负调控MBD2有关，提示miR-520b在胶质瘤中具有肿瘤抑制剂的作用。Lu等〔22〕在头颈癌的研究中发现，miR-520b可通过上皮-间质转化机制抑制癌细胞迁移和侵袭，并增加癌细胞对药物和辐射治疗的敏感性，其机制与miR-520b靶向调控CD44有关，提示miR-520b为难治性HNC治疗的新靶标。本研究发现，miR-520b在口腔鳞癌细胞中表达异常降低；进一步研究发现，过表达miR-520b可抑制Tca8113细胞增殖，促进凋亡和自噬；双荧光素酶报告基因检测实验验证，NEAT1靶向负调控miR-520b，且抑制miR-520b可逆转抑制NEAT1对Tca8113细胞的增殖抑制和凋亡促进作用。综上所述，NEAT1可促进口腔鳞癌细胞的增殖并抑制凋亡和自噬，其机制可能与靶向调控miR-520b有关，为口腔鳞癌的诊断、预防和治疗提供了新的靶点。