丝胶蛋白对2型糖尿病模型大鼠肾脏细胞外信号调节激酶表达的影响

宋妤轩 王丹丹 李东哲 史硕 陈志宏 宋成军

(承德医学院人体解剖学教研室，河北 承德 067000)

目前，糖尿病肾病已成为仅次于原发性肾小球肾炎的导致终末期肾病的第二位原因〔1〕。当糖尿病患者出现尿中泡沫增多、尿量改变(减少或增多)、容易疲倦等表现时，应高度警惕糖尿病肾病的可能。糖尿病患者进展至糖尿病肾病时代谢紊乱更加复杂，尤其是发展到终末期肾病，在治疗上更加困难。因此，尽早防治对于延缓糖尿病肾病的进程意义重大〔2〕。本研究提取彩色蚕茧(黄色蚕茧)中的丝胶蛋白，并给予2型糖尿病模型大鼠灌胃，观察大鼠肾脏细胞外信号调节激酶(ERK)表达的变化，为探寻高效、毒副作用轻的改善糖尿病肾脏损伤的天然物质提供数据支持。

1 材料与方法

1.1 实验材料 健康成年雄性SD大鼠，体重200～250 g，购自河北医科大学实验动物中心(合格证书号712024)，饲养于承德医学院实验动物中心。丝胶的提取和制备：承德医学院蚕业研究所提供彩色蚕茧，纯水浸泡蚕茧后煎煮2次，过滤、合并滤液，加热浓缩，4℃保存，灌胃前用37℃水浴箱复温〔3〕。购于美国Sigma公司的链脲佐菌素(STZ)，使用前用pH4.4的枸橼酸钠/枸橼酸缓冲液配制，浓度为2%；血糖检测试剂盒购于保定长城临床试剂有限公司；尿素氮、肌酐检测试剂盒购于北京首医临床科技中心；尿蛋白酶免分析法(EIA)检测试剂盒购于法国SPI公司；BCA蛋白定量试剂盒购于北京泰格美科技有限公司；兔抗大鼠pERK1/2多克隆抗体(一抗)购于北京博奥森生物技术有限公司；小鼠抗大鼠β-actin单克隆抗体购于美国Santa Cruz公司；山羊抗兔、小鼠IgG二抗购于美国KPL公司；Trizol购于美国Invitrogen公司；ERK和β-actin引物由上海生工生物工程有限公司合成；一步法RT-PCR试剂盒购于大连宝生物工程有限公司。

1.2 实验方法

1.2.1 分组、制备模型和用药 建立模型的方法：2%的STZ以25 mg/kg的剂量给予大鼠腹腔注射(连续3 d)，注射STZ 7 d后空腹血糖不低于16.7 mmol/L作为2型糖尿病大鼠造模成功的标准〔4〕。24只成功建模大鼠随机平均分为模型组和丝胶蛋白组，模型组不做任何处置，丝胶蛋白组按照2.4 g/(kg·d)的剂量灌胃给予丝胶(连续35 d)。另取12只大鼠作为正常对照组，常规饲养。

1.2.2 取材 处死前1 d用代谢笼收集3组24 h尿液，记录尿量。然后，在大鼠腹腔内注射10%水合氯醛麻醉，剂量为0.5 g/kg，通过内眦使用毛细玻璃管收集眶后静脉丛的静脉血，3 000 r/min离心20 min(京立LD4-2A离心机)，收集血清，-20℃冰箱保存。大鼠取血后断头处死，取肾脏入液氮保存。

1.2.3 检测24 h尿蛋白含量 采用EIA方法使用相应试剂盒检测。

1.2.4 检测血液指标 应用日立公司的Boehr inger Mannhe in/Hitachi 717全自动临床生化分析仪采用葡萄糖氧化酶法检测空腹血糖，谷氨酸脱氢酶两点法检测尿素氮含量，酶法检测肌酐含量。

1.2.5 检测肾脏ERK蛋白和mRNA的表达 (1)ERK蛋白(免疫印迹法)：提取肾脏中的总蛋白并定量，蛋白上样量80 μg；15%十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)后转到PVDF膜；5%脱脂奶粉封闭后加入一抗(β-actin 1∶1 000、pERK1/2 1∶100)4℃孵育过夜，加入二抗〔辣根过氧化物酶(HRP)标记，1∶5 000〕室温摇床孵育，最后使用ECL化学超敏发光液显影并扫描胶片。Quantity One软件分析蛋白条带，ERK蛋白的相对表达水平以ERK蛋白条带灰度值与β-actin蛋白条带灰度值的比值表示。(2)ERK mRNA(逆转录-PCR法)：按Trizol试剂相关步骤提取肾脏总RNA，鉴定完整性后逆转录为cDNA，对cDNA产物进行扩增(PCR引物序列及扩增条件见表1。PCR反应条件：94℃预变性2 min、94℃变性30 s、50～65℃退火30 s、72℃延伸1 min，第二步起循环。取PCR扩增产物进行2%琼脂糖凝胶电泳(90 V，40 min)，ZF型紫外透射反射分析仪摄像。Quantity One软件分析显影条带，ERK mRNA的相对表达水平以ERK条带吸光度值与β-actin条带吸光度值的比值表示。

表1 PCR引物序列及扩增条件

1.3 统计学处理 采用SPSS20.0软件进行单因素方差分析和LSD-t检验。

2 结 果

2.1 各组血液指标和尿蛋白检测结果比较 与正常对照组比较，模型组空腹血糖、24 h尿蛋白、血尿素氮、血肌酐明显升高(P<0.05)；与模型组比较，丝胶蛋白组空腹血糖、24 h尿蛋白、血尿素氮、血肌酐明显降低(P<0.05)。见表2。

表2 3组血糖、尿素氮、肌酐和尿蛋白水平比较

与正常对照组比较：1)P<0.05；与模型组比较：2)P<0.05；下表同

2.2 各组肾脏ERK的表达 与正常对照组大鼠比较，模型组肾脏ERK蛋白和mRNA的表达明显升高(P<0.05)；与模型组大鼠比较，丝胶蛋白组肾脏ERK蛋白和mRNA的表达明显降低(P<0.05)。见表3、图1。

表3 3组肾脏ERK表达比较

1～3：正常对照组、模型组、丝胶蛋白组图1 各组肾脏ERK蛋白和mRNA的表达

3 讨 论

在机体内复杂的信息传输网络中，丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)信号转导通路发挥着重要作用〔5〕。ERK是80年代末期发现的一类丝/苏氨酸蛋白激酶，是MAPK家族的重要成员，包括ERK1和ERK2，是将信号从细胞表面的受体传导至细胞核的关键。磷酸化激活的ERK1/2由胞质转位到核内，介导下游因子如Ap-1、c-fos、c-Jun等的转录活化，从而参与细胞的增殖与分化、细胞形态的维持、细胞骨架的构建、细胞凋亡和细胞癌变等多种生物学过程〔6〕。

有研究发现，ERK途径与肿瘤、糖尿病肾病密切相关〔7～9〕。糖尿病肾病是糖尿病微血管并发症之一，但其发病机制目前尚未完全明了，目前认为系多因素参与，在一定的遗传背景及部分危险因素的共同作用下致病。有研究证实，高糖和血管紧张素(Ang)Ⅱ是糖尿病肾病的主要致病因子〔7，10,11〕。正常情况下ERK定位于细胞质，高糖和AngⅡ可导致肾小球系膜细胞ERK转位至细胞核从而被激活，活化后调节核内转录因子活性致系膜细胞肥大，而系膜细胞增生、肥大是糖尿病肾病的主要病理表现之一〔12〕，但糖尿病肾病时ERK具体的激活机制尚不完全清楚。本研究也证实了上述研究结果，糖尿病模型大鼠血糖、肾脏ERK的表达明显升高，肾脏功能明显降低。

糖尿病肾病一般起病隐袭、进展缓慢，当发展为持续性蛋白尿时较多患者亦无明显症状，随着肾脏损害的进一步加重，将逐渐出现肾功能损害(如血肌酐、尿素氮等指标升高)、肾性高血压、水肿等，最后病情进展至晚期可出现严重肾衰竭、尿毒症，是糖尿病患者死亡的主要原因之一〔13〕。有研究证实，改善多种危险因素可明显延缓糖尿病肾脏损害的进展，改善患者的生存质量。鉴于化学合成药物的毒副作用，学者们一直在探寻能有效降低血糖且毒副作用轻或无的天然药物。丝胶蛋白是高分子水溶性蛋白，占蚕茧的25%～30%，我国自古就有蚕茧泡水降血糖的验方。本课题组前期研究显示，丝胶能有效降低2型糖尿病模型大鼠的血糖〔14〕。本研究结果显示，丝胶蛋白可明显降低糖尿病模型大鼠的血糖、肾脏ERK蛋白和mRNA的表达，而且反映肾功能的指标如24 h尿蛋白、血肌酐和尿素氮的含量也明显降低。因此，本研究提示，丝胶可能通过降低血糖影响肾脏ERK的激活，从而减轻ERK介导的肾小球系膜细胞增生、肥大，进而改善肾脏功能。丝胶是天然物质，可避免化学合成药物带来的毒副作用，因此，丝胶在治疗糖尿病肾病及其他糖尿病并发症方面的作用有待深入发掘。