广寄生对糖尿病小鼠肝脏的保护作用及机制

罗泽萍 潘立卫 李丽

(1河池学院化学与生物工程学院，广西 河池 546300；2广西中医药大学药学院药理教研室)

2型糖尿病(T2DM)是一组以高血糖为特征的慢性代谢性疾病，最新的流行病学研究显示我国大约11%的人口患有糖尿病，并呈逐年增长的趋势〔1〕。糖尿病并发症的发生率、致残率和致死率极高，常可累及调节糖脂代谢的肝脏，导致肝损伤和功能障碍，甚至演变为肝硬化或肝癌〔2〕。因此，改善糖尿病引起的肝损伤及促进肝损伤的修复在治疗糖尿病及减少并发症的发生具有重要意义。中草药对于慢性病的治疗，具有西药无法比拟的作用温和持久、多靶点、副作用小及减少并发症发生的优点而成为降血糖药物研究的宝贵资源。广寄生为桑寄生科，钝果寄生属植物。具有治疗腰膝酸软、风湿痹痛、胎漏、胎动及降血压等功效〔3〕。现代药理学研究发现桑寄生科植物具有抗肿瘤、降血脂、抗炎、镇痛、抗氧化及加快消耗HepG2细胞葡萄糖等作用〔4～10〕，而有关桑寄生科植物降血糖作用的研究甚少，本研究旨在探讨桑寄生科植物广寄生对T2DM小鼠肝脏的保护作用及机制。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 动物 SPF级昆明小鼠，雌雄各半，体重(20±2)g，广西医科大学动物实验中心提供，合格证号SCXK(桂)2014-0002。

1.1.2 药物 广寄生采摘于广西河池市宜州区郊外，经河池学院化学与生物工程学院邓晰朝副教授鉴定为广寄生(寄主为桑树)的茎叶，药物提取方法：广寄生50℃烘干，粉碎成粗粉。取粗粉5 kg，依次用95%乙醇、60%乙醇渗漉提取，各收集10倍量(体积)渗漉液，渗漉液合并，减压回收乙醇，得总提取物浸膏约614.3 g，4℃冰箱保存，备用。

1.1.3 主要仪器 XL-300全自动生化分析仪(德国欧霸ERBA公司)；xMark酶标仪(美国伯乐BIO-RAD公司)；DH-20F台式高速冷冻离心机(长沙百诺克离心机仪器有限公司)；AUW220D分析天平(日本岛津公司)；HH-S4数显恒温水浴锅(金坛市医疗仪器厂)。

1.1.4 主要试剂 葡萄糖测定试剂盒(长春汇力生物技术有限公司，2017033)；谷草转氨酶(AST)测定试剂盒(长春汇力生物技术有限公司，2017007)；谷丙转氨酶(ALT)测定试剂盒(长春汇力生物技术有限公司，2017022)；总胆固醇(TC)测定试剂盒(南京建成生物工程研究所，20171218)；三酰甘油(TG)测定试剂盒(南京建成生物工程研究所，20171216)；链脲佐菌素(STZ，Sigma，S0130)；碱性磷酸酶(ALP)测定试剂盒(南京建成生物工程研究所，20171221)；超氧化物歧化酶(SOD)活性测定试剂盒、丙二醛(MDA)测定试剂盒、总抗氧化能力(T-AOC)测定试剂盒(南京建成生物工程研究所，20171218)；白细胞介素(IL)-2、4、12酶联免疫吸附试验( ELISA)试剂盒、γ-干扰素ELISA试剂盒、B细胞淋巴瘤因子(Bcl)-2 ELISA试剂盒、Bcl-2相关X蛋白(BAX)ELISA试剂盒、血红素氧合酶(HO)-1 ELISA试剂盒、Toll样受体(TLR)-4 ELISA试剂盒、核因子(NF)E2相关因子(Nrf2)ELISA试剂盒、NF-κB亚基p65亲和肽(NF-κBp65)ELISA试剂盒及过氧化物酶体增殖剂激活受体(PPAR)-α ELISA试剂盒(上海优选生物科技有限公司；201804)。

1.2 方法

1.2.1 T2DM小鼠肝损伤模型制备 高糖高脂饲料喂养4 w后，连续7 d腹腔注射STZ 45 mg/(kg·d)。7 d后，检测空腹血糖(FBG)≥12 mmol/L视为高血糖模型形成。T2DM继续给予高糖高脂饲料喂养4 w后，检测肝脏功能指标变化，与空白对照组相比，以ALT、AST及ALP活性明显升高(P<0.05)，确定T2DM小鼠肝损伤模型建立。

1.2.2 分组及给药 随机把T2DM肝损伤小鼠分为5组，分别为阳性对照组〔二甲双胍150 mg/(kg·d)+联苯双酯150 mg/(kg·d)〕、模型对照组(等体积生理盐水)、广寄生高剂量组〔36 g/(kg·d)〕、中剂量组〔18 g/(kg·d)〕及低剂量组〔9 g/(kg·d)〕各12只。另设空白对照组(等体积生理盐水)小鼠12只。药物或生理盐水灌胃4 w末，摘眼球取血后，立即解剖取肝脏，用预冷的生理盐水冲洗3次后置-80℃冰箱保存。

1.2.3 血清相关指标测定 按试剂盒说明书操作测定血清FBG、TC、TG、ALT、AST、ALP、SOD、MDA及T-AOC水平。

1.2.4 肝组织相关指标测定 按试剂盒说明书制备肝组织匀浆测定IL-2、IL-4、IL-12、IFN-γ、Bcl-2、BAX、HO-1、TLR4、Nrf2、NF-κBp65及PPAR-α的含量。

1.2.5 肝细胞观察 肝组织经过石蜡包埋、切片、苏木素-伊红(HE)染色之后在光学显微镜下观察肝细胞形态结构变化。

1.3 数据分析 采用SPSS13.0软件进行单因素方差分析。

2 结 果

2.1 血糖、血脂测定结果 与空白对照组相比，模型对照组FBG、TC及TG均明显升高(P<0.01)。阳性对照组、广寄生高、中、低剂量组FBG、TC及TG均较模型对照组显著降低(P<0.01，P<0.05)。见表1。

表1 广寄生对T2DM小鼠血糖、血脂的影响

与空白对照组比较：1)P<0.01；与模型对照组比较：2)P<0.05，3)P<0.01；下表同

2.2 肝功能指标测定结果 与空白对照组相比，模型对照组ALT、AST及ALP均明显升高(P<0.01)。阳性对照组、广寄生高、中及低剂量组ALT、AST及ALP均明显低于模型对照组(P<0.01，P<0.05)。见表2。

表2 广寄生对T2DM小鼠肝功能指标的影响

2.3 抗氧化能力的测定结果 与空白对照组相比，模型对照组MDA值明显升高，而SOD和T-AOC活性明显降低(P<0.01)。阳性对照组、广寄生高、中及低剂量组MDA值较模型对照组明显下降、SOD和T-AOC活性明显升高(P<0.01，P<0.05)。见表3。

表3 广寄生对T2DM小鼠抗氧化能力的影响

2.4 免疫指标测定结果 与空白对照组相比，模型对照组IL-2、IL-4值明显降低，IL-12、IFN-γ值明显升高(P<0.01)。阳性对照组、广寄生组IL-2、IL-4值较模型对照组明显升高，IL-12、IFN-γ明显降低(P<0.01，P<0.05)。见表4。

表4 广寄生对T2DM小鼠肝细胞因子的影响

2.5 肝细胞凋亡相关指标的测定结果 与空白对照组相比，模型对照组Bcl-2、HO-1、Nrf2、PPAR-α值显著降低，Bax、TLR4、NF-κBp65显著升高(均P<0.01)；与模型对照组比较，阳性对照组、广寄生组Bcl-2、HO-1、Nrf2、PPAR-α值明显升高，Bax、TLR4、NF-κBp65值明显降低(P<0.01，P<0.05)。见表5。

表5 广寄生对T2DM小鼠肝细胞凋亡相关指标的影响

2.6 小鼠肝细胞 HE 染色图 空白对照组小鼠肝组织结构完整，肝细胞分界清晰，大小均匀，细胞核圆而清晰。模型对照组小鼠肝细胞结构异常，肝组织有大量空泡，细胞核固缩。阳性对照组和广寄生高、中、低剂量组小鼠肝细胞结构紊乱明显改善，不同程度的减轻糖尿病小鼠肝脏病理改变。见图1。

图1 各组肝细胞HE染色(×40)

3 讨 论

长期高血糖应激导致体内的葡萄糖和脂肪酸不能被很好利用，致使多余的葡萄糖和脂肪酸在肝脏内转变成脂肪，脂肪在肝内的沉积导致肝损伤，严重者可转变为肝纤维化、肝硬化甚至肝癌，因此对糖尿病肝损伤的干预十分重要。机体血糖升高时，肝脏内脂质合成也增加，血清TC、TG增高均多见于糖尿病患者〔11〕。本研究表明广寄生具有降血糖的作用，其降血糖作用可能与改善T2DM小鼠脂代谢紊乱有关。ALT、AST及ALP存在肝细胞内，当肝脏受到损伤或者出现功能障碍时，便释放到血液中导致血清ALT、AST及ALP升高〔12〕。本研究结果说明广寄生对T2DM造成的肝损伤有一定的保护作用。糖尿病患者内分泌紊乱会导致活性氧(ROS)代谢失调，体内过多的ROS是导致糖尿病并发症和细胞损伤的重要因素〔13〕。本研究结果说明广寄生能提高T2DM小鼠抗氧化能力从而在一定程度上减少T2DM并发症的发生。细胞因子是T2DM发病的重要促进因子，INF-γ对胰岛β细胞有直接的细胞毒性作用，而IL-4具有促进B细胞增殖和分化，对自身免疫性糖尿病有很强的保护作用〔14〕。IL-12水平升高可加重胰岛素抵抗同时可直接影响β细胞增殖、分化和IFN-γ产生〔15〕，IL-2因促进B淋巴细胞的生长，刺激抗体合成而发挥重要的免疫调节作用〔16〕。糖尿病患者常因免疫功能低下而并发感染，因此，提高机体免疫功能，在减少并发症的发生具有重要意义。本研究发现，广寄生能降低T2DM小鼠肝细胞INF-γ、IL-12值，升高IL-2、IL-4水平，以提高免疫功能，对防治T2DM感染具有重要意义。细胞凋亡受到细胞内凋亡调节蛋白的调控，而凋亡蛋白又分为促凋亡蛋白和抗凋亡蛋白两大类。Bcl-2、Bax分别发挥抗凋亡和促凋亡作用，两者的比值决定着细胞凋亡的发生〔17〕。本研究发现广寄生具有增强T2DM小鼠的Bcl-2转录活性，同时降低Bax转录活性。HO-1通过抗炎、抗凋亡、抗老化及改善微循环而起到保护细胞内源性蛋白的作用〔18〕。本实验发现广寄生具有增强T2DM小鼠肝组织的HO-1活性作用，表明广寄生的降糖保肝作用可能与增强肝组织HO-1活性有关。在高血糖状态下，TLR4作为机体炎性反应链的启动蛋白促使炎症反应而导致使肝细胞受损、凋亡及功能障碍〔19〕。本实验发现广寄生能降低T2DM小鼠肝组织TLR4含量，从而降低糖尿病性肝炎或肝损伤的发生。持续的高血糖会诱发ROS产生，过多的ROS导致胰岛素抵抗。Nrf2可以减少ROS的产生，减少由氧化应激介导的自噬性胰岛β细胞凋亡从而改善由氧化应激诱导的胰岛素抵抗〔20〕。本实验发现广寄生能升高T2DM小鼠肝组织Nrf2含量，说明广寄生的保肝作用与增强Nrf2转录活性改善胰岛素抵抗的作用有关。NF-κB与糖尿病患者胰岛细胞的增殖和凋亡关系密切，p65蛋白作为NF-кB通路蛋白家族的重要组分能加速炎症基因表达〔21〕。本实验发现广寄生能降低T2DM小鼠肝组织NF-κBp65的含量，表明广寄生的保肝作用与降低炎症基因表达的作用有关。PPAR-α在脂肪酸、脂蛋白代谢的过程具有调节脂代谢、糖代谢、改善胰岛素抵抗的作用〔22〕。本研究发现广寄生能升高T2DM小鼠肝组织PPAR-α含量，说明广寄生的保肝作用与增强PPAR-α转录活性，改善糖尿病代谢紊乱的作用有关。