复方芪藻汤调控FoxO3a/FasL/Caspase8抑制实验性胃溃疡大鼠胃黏膜上皮细胞凋亡

陈畅 隋璐 赵春莹

(沈阳医学院基础医学院，辽宁 沈阳 110034)

胃溃疡可由幽门螺杆菌感染、药物、激素、应激、不良生活习惯等多种原因诱发，临床上主要表现为节律性、周期性、易复发性上腹痛，常可导致出血、穿孔、甚至癌变。胃溃疡可发生于任何年龄，中老年人群中更为多见，男性患者多于女性〔1,2〕。当前治疗胃溃疡的常规疗法即三联疗法正面临着用药周期长、愈合不完善、长期给药对肝肾毒副作用大、停药易复发的问题。与之相比，中医药在治疗胃溃疡方面具有独特的优势。复方芪藻汤(FFQZT)是一味针对溃疡病脾胃虚寒病机的中药方剂，具有高治愈率、低副作用、同时价格低廉的优点。但FFQZT的作用机制尚不明确。本研究拟通过外源性凋亡通路叉头框蛋白(Fox)O3a/人凋亡相关因子配体(FasL)/半胱氨酸天冬氨酸蛋白配(Caspase)8探讨FFQZF修复胃黏膜损伤的可能机制。

1 材料与方法

1.1 实验动物 SPF级Wistar大鼠60只，雌雄各半，体重180～220 g，购自辽宁长生生物技术有限公司，动物合格证号为SCXK(辽)2015-0001。适应性饲养2 w，自由进食、饮水。

1.2 实验药物 FFQZT(螺旋藻多糖18 g，黄芪20 g，白芨15 g，乌贼骨10 g)购自沈阳国大药房。奥美拉唑肠溶胶囊购自悦康药业集团有限公司生产(批号14370242)。

1.3 主要试剂与仪器 兔抗大鼠FoxO3a单克隆抗体(CST)，兔抗大鼠FasL多克隆抗体、兔抗大鼠Caspase8多克隆抗体(武汉博士德生物技术有限公司)，兔抗大鼠3-磷酸甘油醛脱氢酶(GAPDH)多克隆抗体、山羊抗兔二抗(上海索莱宝生物科技有限公司)，二喹啉甲酸(BCA)蛋白浓度测量试剂盒、十二烷基硫酸钠(SDS)-聚丙烯酰胺凝胶(PAGE)试剂盒、超敏电化学发光试剂盒(碧云天生物技术公司)，链霉菌抗生素蛋白-过氧化物酶链接法(SP)试剂盒、二氨基联苯胺(DAB)显色液(北京中杉金桥生物技术有限公司)。低温超速离心机(德国Heraeus Sepatech公司)，ELx800酶标仪(美国BioTek公司)，Bio-Rad 电泳仪、转膜仪(美国Bio-Rad公司)，凝胶成像系统(美国Bio-Rad公司)，石蜡切片机(山东博科生物产业有限公司)。

1.4 动物分组与模型制备 将大鼠随机分为空白组、模型组、FFQZT低剂量组、FFQZT中剂量组、FFQZT高剂量组、奥美拉唑组各10只。采用乙酸烧灼法制备胃溃疡模型。空白组不做处理，其余各组均以3%戊巴比妥钠麻醉。麻醉后，常规剪毛并消毒手术区，自剑突下沿腹中线稍左做约2 cm的切口，自肝后牵引出胃，在胃前壁胃窦与胃体交界处，贴附浸泡了冰醋酸的滤纸片，共贴附2次，每次30 s。吸去残留乙酸，用大网膜覆盖后将胃送回腹腔，逐层缝合腹壁。术后1 d内禁食。自造模成功后第3天开始灌胃，空白组及模型组给予1 ml/100 g生理盐水灌胃；FFQZT低、中、高剂量组分别给FFQZT 3 g/kg、6 g/kg、12 g/kg，奥美拉唑组给奥美拉唑水溶液3.6 mg/kg，1次/d，连续给药14 d。

1.5 标本采集 大鼠第14天灌胃后，禁食不禁水24 h，次日处死取材。处死后开腹取胃，沿较大曲率剪开，用冰生理盐水冲洗胃腔后，在冰袋上展平胃部。将溃疡灶及其周边3 mm范围内的组织切下，组织块大小为1.0 cm×1.1 cm，均分为两部分。一部分迅速投入液氮中-80℃冻存，备做Western印迹检测；另一部分4%多聚甲醛固定1 d，制成蜡块，备做免疫组化染色。

1.6 Western印迹检测FoxO3a、FasL、Caspase8蛋白表达 每个样品剪取约20 mg的组织，充分裂解后，4℃下14 000 r/min离心5 min，取上清液，用BCA检测试剂盒测定蛋白浓度并计算上样量。将煮好的蛋白加入10%SDS-PAGE中，以120 V 电泳1 h。电泳结束后取出凝胶，加入转膜液，转膜条件是250 mA下转膜90 min。室温下用脱脂奶粉封闭1 h，一抗4℃过夜(FoxO3a 1∶1 000、FasL 1∶1 500、Caspase8 1∶1 000、GAPDH 1∶1 000)，二抗室温1 h(羊抗兔免疫球蛋白G1∶10 000)，超敏电化学发光液曝光。Image J测定曝光条带灰度值。

1.7 免疫组化法检测大鼠胃黏膜上皮中FoxO3a、FasL、Caspase8的表达 4 μm切片常规脱蜡至水，乙二胺四乙酸(EDTA)微波修复后按SP试剂盒说明书进行染色，以磷酸盐缓冲液(PBS)替代一抗作为阴性对照。阳性指标为细胞核或细胞质呈棕褐色。每张切片在高倍镜(×400)下随机选取5个视野，根据染色强度与阳性细胞数采用评分法进行评估，结果取均值〔3〕。根据染色强度计分：无色0分，淡黄色1分，棕黄色2分，棕褐色3分。根据阳性细胞数计分：无阳性细胞0分， ≤10%计1分，11%～50%计2分，51%～75%计3分，>75%计4分。将染色强度计分与阳性细胞数乘积为评估标准，乘积≥4分为阳性。

1.8 统计学分析 采用SPSS17.0软件进行单因素方差分析、LSD-t检验、χ2检验。

2 结 果

2.1 Western印迹法检测FoxO3a、FasL、Caspase8蛋白表达 模型组FoxO3a、FasL、Caspase8蛋白水平明显高于空白组(P<0.05)；与模型组相比，FFQZT高剂量组Foxo3a、FasL、Caspase8蛋白水平明显降低(P<0.05)，FFQZT低、中剂量组Foxo3a、FasL蛋白和FFQZT低剂量组Caspase8蛋白差异均无统计学意义(P>0.05)。见图1、表1。

1～6：空白组、模型组、FFQZT低剂量组、FFQZT中剂量组、FFQZT高剂量组、奥美拉唑组图1 Western印迹法检测Foxo3a、FasL、Caspase8蛋白表达

组别FoxO3aFasLCaspase8空白组0.65±0.141)0.57±0.111)0.46±0.141)模型组1.06±0.321.29±0.311.14±0.29FFQZT低剂量组0.97±0.320.96±0.300.99±0.37FFQZT中剂量组0.90±0.190.89±0.490.82±0.271)FFQZT高剂量组0.71±0.101)0.77±0.331)0.61±0.231)奥美拉唑组0.85±0.201)0.80±0.171)0.78±0.141)

与模型组相比：1)P<0.05

2.2 免疫组化法检测大鼠胃黏膜上皮中FoxO3a、FasL、Caspase8的表达 免疫组化结果显示FoxO3a表达位点位于细胞核(图2)，FasL、Caspase8表达位点位于细胞质(图3、图4)。各组FoxO3a、FasL、Caspase8表达水平存在明显差异(P<0.01)。空白组少见FoxO3a、FasL、Caspase8阳性细胞；模型组可见大量FoxO3a、FasL、Caspase8阳性细胞，染色范围广且染色强度较深；与模型组相比，FFQZT中、高剂量组及奥美拉唑组Foxo3a、FasL、Caspase8阳性表达均下降，而与奥美拉唑组相比，FFQZT高剂量组FoxO3a、FasL、Caspase8表达下降最明显，见表2。

图2 FoxO3a在大鼠胃黏膜上皮表达情况(×400)

图3 FasL在大鼠胃黏膜上皮表达情况(×400)

图4 Caspase8在大鼠胃黏膜上皮表达情况(×400)

组别FoxO3a阴性阳性FasL阴性阳性Caspase8阴性阳性空白组9110091模型组191919FFQZT低剂量组193719FFQZT中剂量组465546FFQZT高剂量组917382奥美拉唑组827364χ2/P值29.676/<0.0121.715/<0.0123.767/<0.01

3 讨 论

FFQZT是一味抗溃疡与养胃兼用的中药方剂，具有降低胃液胃酸分泌、促进溃疡愈合、保护胃黏膜、提高机体免疫功能的作用。研究表明螺旋藻多糖对大鼠实验性胃溃疡有促进溃疡愈合、保护胃黏膜的作用〔4〕。黄芪具有补气升阳，益固表卫，利水消肿，托疮生肌之功效，还能增强机体免疫功能，促进细胞代谢，且黄芪与黄芪提取物对幽门螺杆菌有直接杀灭的作用〔5〕;乌贼骨可制酸止痛、收湿敛疮,其成分碳酸钙具有中和胃酸、促进溃疡面炎症吸收的作用，与抗生素联合应用可降低不良反应和耐药性〔6〕;白及具有高黏度性，口服后可在胃黏膜表面形成一层保护膜,阻止胃酸、胃蛋白酶及其他理化因素对溃疡的进一步侵袭,同时发挥收敛、止血的功效，有利于溃疡的愈合及修复〔7〕。

胃溃疡的致病机制尚未完全明确，但已有研究证实，胃黏膜上皮细胞凋亡在胃溃疡发生与愈合中均有重要作用〔8〕。细胞凋亡是细胞的程序性死亡方式，这个过程与细胞增殖、分化共同贯穿于生命的始终，是生命体正常生长、发育与死亡所不可缺少的。细胞凋亡的途径有两种，分别是由死亡受体起始的外源性途径和线粒体起始的内源性途径。

FoxO3a属于Forkhead家族中的O亚族，是该家族的核心蛋白，在各组织器官中均有广泛表达。作为细胞生命活动的重要参与者，FoxO3a在细胞凋亡、氧化应激、细胞周期等过程中都起着关键性作用，其中最主要的功能是调控细胞凋亡〔9〕。FoxO3a的活性受其上游因子调控，蛋白激酶B(Akt)、血清/糖皮质激素调节激酶(SGKs)、IKB激酶(IKK)等因子可抑制FoxO3a活性，c-Jun氨基末端激酶(JNK)、腺苷酸活化蛋白激酶(AMPK)等因子可增强FoxOsa活性。当抑制性因素作用于FoxO3a时，会将其磷酸化，磷酸化的FoxO3a与DNA的亲和力下降，与细胞核内的14-3-3核输出蛋白结合，发生核排斥，FoxO3a会被移出细胞核转移到细胞质中，泛素化降解，丧失转录活性，从而失去控制细胞凋亡的能力；当抑制性因素作用于FoxO3a时，会促使去磷酸化的FoxO3a转移到细胞核，激活下游凋亡相关因子，介导细胞凋亡〔10,11〕。

FasL是FoxO3a下游的靶蛋白，是肿瘤坏死因子受体(TNFR)超家族的重要成员，在外源性凋亡通路中起重要的作用，主要表达位点在T细胞。FasL和Fas常相互配合，在细胞膜上形成诱导凋亡的复合体，该复合体可吸引细胞质中与带有相同死亡结构域蛋白的FADD结合，激活Caspase家族〔12〕。Caspase家族主要包括凋亡启动因子、凋亡执行因子和炎症介导因子。Caspase8是凋亡启动的核心，FasL与 Caspase8结合后，使Caspase8活化，活化的Caspase8可以引起Caspase凋亡级联反应，破坏细胞内死亡结构蛋白及功能蛋白，最终激活凋亡执行的关键蛋白Caspase3，引起细胞凋亡〔13,14〕。

本研究中，模型组FoxO3a、FasL、Caspase8蛋白表达明显高于空白组，而在应用了FFQZT后凋亡相关蛋白 FoxO3a、FasL、Caspase8蛋白表达明显下降。综上，FFQZT可能是通过调控FoxO3a/FasL/Caspase8通路从外源性途径抑制细胞凋亡，从而发挥修复胃黏膜的作用。