芒柄花黄素对宫颈癌细胞放疗敏感性的影响

高咏梅 仵妍 徐晖 周晓 鲁强

(1青岛大学附属青岛海慈医疗集团妇科，山东 青岛 266000；2山东大学第二附属医院妇科)

据世界卫生局数据估算，每年宫颈癌新增病例有近53万之多，80%的宫颈癌患者来自发展中国家〔1～3〕。宫颈癌早期没有明显症状及特殊体征，易被误诊、漏诊，确诊时常为中晚期。晚期宫颈癌主要采用单独放疗或放疗结合化疗治疗〔4,5〕。接受根治性放疗的患者仍有转移和复发，且单独放疗预后不佳。因此如何预测宫颈癌的放疗敏感性，采用放疗联合其他方法增强宫颈癌的治疗效果是研究的重点。近年来宫颈癌增敏治疗引起研究者的极大关注，即抗癌药物作为放射增敏剂，对放射产生的生物效应进行修饰，增加射线对肿瘤组织的敏感性。芒柄花黄素是一种异黄酮类植物雌激素，广泛存在于甘草、葛根、红三轴草等豆科植物中，具有抗肿瘤活性〔6～10〕，但是否可以作为新的放射增敏剂提高宫颈癌疗效尚未见报道。本文主要研究芒柄花黄素对宫颈癌细胞的放射增敏作用。

1 材料与方法

1.1 实验材料 人宫颈癌细胞系HeLa细胞购自中国科学院上海细胞库；RPMI1640细胞培养液、青霉素、链霉素为Hyclone公司产品；新生牛血清购自杭州四季青生物工程材料有限公司；FITC-膜联蛋白(Annexin)V、碘化丙啶(PI)、噻唑蓝(MTT)、二甲基亚砜(DMSO)购于Sigma公司；芒柄花黄素购自陕西慧科植物开发有限公司；兔源Ki-67多克隆抗体、β-actin抗体及酶标二抗均为美国Cell Signaling Technology公司产品；二喹啉甲酸(BCA)蛋白定量试剂盒购自Thermo Scientific公司；0.25%胰蛋白酶溶液购自HyClon公司，其余试剂为国产分析纯；医用直线加速器购自Siemens公司；680全自动酶标仪、流式细胞仪购自BD公司，其他常用试剂购自上海生工公司。

1.2 HeLa细胞的复苏及培养 将液氮冻存的HeLa细胞于37℃水浴锅中快速解冻，无菌操作将细胞转移至15 ml离心管中，加入10 ml RPMI1640培养基，室温下600 r/min离心10 min，弃上清，用RPMI1640培养基重悬，细胞培养在含10%新小牛血清、青/链霉素各100 U/ml的RPMI1640培养基中，5%CO2、37℃，饱和湿度下培养，取对数期细胞进行试验。

1.3 细胞照射 收集药物处理后的HeLa细胞，X线垂直照射细胞，辐射剂量为0、2、4、6、8 Gy，检测细胞凋亡的辐射量选择4 Gy，照射后细胞置于培养箱中继续培养48 h，收集细胞进行后续实验。

1.4 MTT法检测HeLa细胞的增殖 取对数生长期的HeLa细胞加入含有芒柄花黄素(终浓度为10 μmol/L)的RPMI1640培养基，每个浓度设置6个复孔，以不加芒柄花黄素的HeLa细胞为对照组，然后进行X线照射，辐射剂量分别为0、2、4、6、8 Gy，收集细胞消化并稀释，以2×105/孔的密度接种于96孔板中培养48 h后，每孔加入20 μl MTT (5 mg/ml)作用3 h，弃掉培养液，每孔加入150 μl DMSO放入摇床至完全溶解甲臜，震荡摇匀后，检测每孔细胞在490 nm的吸收值。计数增殖抑制率=(对照组OD值-实验组OD值)/对照组OD值×100%。

1.5 克隆形成实验 取对数生长期的HeLa细胞进行辐射剂量分别为0、2、4、6、8 Gy的照射后，加入含有芒柄花黄素(终浓度为10 μmol/L)的RPMI1640培养基，以不加芒柄花黄素的HeLa细胞为对照组，培养48 h后收集细胞，将各组单细胞悬液接种到6孔板中，于37℃，5%CO2的培养箱中继续培养10～14 d，磷酸盐缓冲液(PBS)清洗3次，甲醇固定后，用结晶紫染色并于显微镜下进行集落计数(>50个细胞的集落为有效集落)，计算克隆形成率及根据单击多靶模型拟合细胞存活曲线。

1.6 流式细胞仪检测HeLa细胞凋亡 取对数生长期的HeLa细胞加入含有芒柄花黄素(终浓度为10 μmol/L)的RPMI1640培养基，以不加芒柄花黄素的HeLa细胞为对照组，然后进行辐射剂量为4 Gy的照射后，继续培养48 h收集细胞，将细胞消化计数并接种到6孔板中，PBS清洗3次，加入500 μl结合缓冲液悬浮细胞，调整细胞浓度为5×105/孔，各孔加入5 μl Annexin V-FITC和5 μl PI混匀，室温避光反应10 min后上流式细胞仪检测细胞凋亡率。

1.7 Western印迹检测Ki-67的表达 按流式细胞仪检测凋亡的实验方法分组处理，将照射后的HeLa细胞消化并离心收集，加入RIPA使细胞裂解，超声波破碎后离心收集蛋白，BCA试剂盒测定蛋白浓度。每个样本取50 μg进行12%十二烷基硫酸钠(SDS)-聚丙烯酰胺凝胶(PAGE)电泳，将分离后的蛋白进行转膜，5%脱脂奶粉室温封闭1 h后，加入Ki-67一抗，4℃孵育过夜，TBST洗膜3次，加入辣根过氧化酶标记的二抗，37℃孵育1 h。电化学发光(ECL)显影检测蛋白表达。

1.8 统计分析 采用SPSS17.0软件进行t检验或方差分析。

2 结 果

2.1 芒柄花黄素对放疗后HeLa细胞增殖的影响 辐射剂量为0、2、4、6、8 Gy时，芒柄花黄素联合放疗组HeLa细胞增殖抑制率明显高于对照组(均P<0.05)。见表1。

表1 两组不同放疗剂量细胞增殖抑制率比较

2.2 芒柄花黄素对放疗后HeLa细胞克隆形成率的影响 芒柄花黄素联合放疗组2、4、6、8 Gy时HeLa细胞克隆形成率明显低于对照组(P<0.05)。见表2。对克隆形成实验数据进行曲线拟合，发现芒柄花黄素联合放疗组具有较高的放疗敏感性，曲线参数见表3。

2.3 芒柄花黄素对放疗后HeLa细胞凋亡的影响 芒柄花黄素联合放疗组HeLa细胞凋亡率明显高于对照组〔(40.59±4.06)% vs (28.54±2.84)%，P<0.05〕。

2.4 芒柄花黄素对放疗后HeLa细胞Ki-67表达的影响 芒柄花黄素联合放疗组的Ki-67蛋白表达量较对照组明显提高(0.82±0.08 vs 0.44±0.05，P<0.05)。见图1。

表2 两组不同放疗剂量细胞克隆形成率比较

表3 两组克隆形成实验单击多靶模型的参数值(n=9)

图1 Western印迹检测后HeLa细胞Ki-67蛋白表达

3 讨 论

宫颈癌是妇科肿瘤中的恶性肿瘤之一，严重威胁女性的健康和生命。现在生活节奏的加快使宫颈癌的发病年龄日趋年轻化，对患者造成沉重的生活压力，已经成为亟待解决的社会问题〔11〕。对于宫颈癌的治疗，手术和辅助放疗依然是最常用的治疗手段〔12〕。影响放疗的最主要因素是实体瘤存在乏氧细胞，其对放射线的耐受比氧细胞强2.5～4倍，造成常规放疗不能杀死这些细胞，限制了放疗的效果，是肿瘤复发和转移的根源〔13〕。利用抗癌药增加生物体的放疗敏感性，提高肿瘤治愈率，对临床治疗具有重要意义。

紫杉醇、多西他赛、砒霜、羟基喜树碱和芒柄花黄素等均为抗癌类药物，研究发现很多抗癌药可以提高肿瘤的放疗敏感性。Jin等〔14〕研究发现抗癌药紫杉醇和SR-2508结合使用可以提高宫颈癌HeLa细胞的放疗敏感性；Pradier等〔15〕研究发现多西他赛使宫颈癌CaSki细胞的G2/M期细胞比例明显提高，提高对宫颈癌CaSki细胞的放疗增敏效果；As2O3是中药砒霜的主要成分，Chun等〔16〕发现As2O3通过抑制HeLa细胞的亚致死损伤的修复，改变细胞周期，诱导细胞凋亡，提高宫颈癌细胞的放疗敏感性；周斌等〔17〕研究表明羟基喜树碱对HeLa细胞具有放疗增益作用，其增益作用有时序、浓度和时间依赖性。

芒柄花黄素是一种具有类雌二醇分子结构的异黄酮化合物，通常具有预防心血管疾病、清除氧自由基、抗癌、舒缓妇女更年期症状、预防骨质疏松等保健作用〔18〕。研究表明芒柄花黄素对前列腺癌〔6〕、乳腺癌〔7,9〕、宫颈癌〔10〕等均有抑制作用，本研究中结果表明经过放疗处理后，芒柄花黄素可以明显抑制HeLa细胞的增殖，促进HeLa细胞的凋亡，明显降低HeLa细胞的克隆形成率，细胞增殖相关蛋白Ki-67的蛋白表达量也明显提高。综上可知，芒柄花黄素可以显著提高宫颈癌细胞的放疗敏感性，是宫颈癌潜在的放疗增敏剂，对提高宫颈癌细胞的放疗治疗效果具有重要意义。