尼达尼布对百草枯致老年小鼠肺纤维化的保护作用及机制

吕骁 张宏英 翁恒 毛雅云 林旭

(福建医科大学教学医院福建省福州肺科医院，福建 福州 350000)

百草枯(PQ)能够造成肺泡上皮的氧化损伤从而导致呼吸衰竭，随后发生纤维化，是导致患者致死的主要原因〔1〕。然而目前PQ没有真正的药理学拮抗剂，也没有能够结合血液或其他组织中毒物的螯合剂〔2〕。尼达尼布(NIB)作为一种抑制剂能够靶向作用于多种酪氨酸激酶〔3〕，可以改善特发性肺纤维化患者肺部纤维化程度，但是对于PQ诱导的老年小鼠肺纤维化目前尚无报道。本研究探讨NIB对于PQ诱导的老年小鼠肺纤维化的作用及机制。

1 材料与方法

1.1 主要试剂 蛋白激酶B(AKT)，细胞外调节蛋白激酶(ERK)，血小板衍生的生长因子受体(PDGFR)抗体购于cell signaling technology 公司。NIB购于MCE公司。HE和Masson染色试剂盒由北京海德创业公司提供。白细胞介素(IL)-1β，肿瘤坏死因子(TNF)-α检测试剂盒购自上海蓝基生物公司；丙二醛(MDA)及髓过氧化物酶(MPO)检测试剂盒购自上海翔升生物公司。

1.2 方法

1.2.1 模型建立及实验分组 20～24周龄，体重30～35 g C57BL/6老年雄性小鼠36只，由北京华孚康生物科技实验动物中心提供，随机分为假手术(Sham)组，PQ组、PQ+NIB组，每组12只。通过给予小鼠PQ 20 mg/kg灌胃来建立肺纤维化模型，Sham组则给予等量生理盐水，连续给药3 d，之后PQ+NIB组给予NIB 60 mg/kg灌胃干预。在干预7 d后每组小鼠取血后处死，收集肺组织。

1.2.2 检测方法 (1) 应用酶联免疫吸附试验检测小鼠血清TNF-α、IL-1β水平，肺脏组织MDA、MPO水平。(2)留取肺组织，应用二喹啉甲酸(BCA)蛋法提取肺组织蛋白。

1.2.3 Western印迹法检测PDGFRα、PDGFRβ、磷酸化(p)-PDGFRαβ、p-AKT、p-ERK的表达水平 将提取后的蛋白进行上样，电泳，转膜，封闭，洗膜，一抗4℃过夜孵育，用洗膜液漂洗后，二抗杂交1 h，清洗后加上电化学发光剂(ECL)显色，上机检测。

1.2.4 肺组织病理形态学观察 取肺组织，常规冲洗后多聚甲醛固定，石蜡包埋切片并经苏木素-伊红(HE)和马松(Masson)染色法显微镜下观察各组肺部的炎症浸润及纤维化情况。

1.2.5 细胞凋亡实验 采用Tunel试剂盒进行染色，显微镜下可观察到深棕色细胞核，此为凋亡细胞。根据以下公式进行凋亡率的计算：凋亡率(%)=凋亡细胞数/总细胞数×100%，每个样本随机计数5个视野，取均值。

1.3 统计学分析 使用SPSS18.0软件进行单因素方差分析、LSD-t检验。

2 结 果

2.1 各组血清TNF-α、IL-1β水平及肺脏组织、MDA、MPO水平比较 与Sham组比较，PQ组血清TNF-α、IL-1β水平及肺组织MDA、MPO水平均显著升高(P<0.05)，提示造模成功。PQ+NIB组上述各项指标的升高程度均较PQ组明显缓解(P<0.05)。见表1。

表1 各组TNF-α、IL-1β、MDA、MPO表达水平比较

与Sham组比较:1)P<0.05；与PQ组比较:2)P<0.05;同下表

2.2 肺组织病理学观察 与Sham组相比，HE染色下PQ组小鼠肺组织水肿，中性粒细胞大量浸润，肺泡壁增厚。Masson染色显示PQ组小鼠肺组织纤维化明显增加，PQ+NIB组肺脏病理改变明显缓解。见图1。

2.3 肺组织Tunel染色 较Sham组〔(3.1±0.42)%〕相比，PQ组小鼠肺组织中Tunel阳性细胞显著增加〔(39.2±4.67)%，P<0.05〕，与PQ组比较，PQ+NIB组肺脏Tunel阳性细胞的增加程度明显缓解〔(15.6±1.22)%,P<0.05〕。见图2。

2.4 Western印迹检肺组织PDGFRα、PDGFRβ、P-PDGFRαβ、P-AKT、P-ERK蛋白表达 与Sham组比较，PQ组p-PDGFRαβ、p-AKT、p-ERK蛋白表达水平明显升高(P<0.05)，PQ+NIB组上述蛋白水平明显低于PQ组(P<0.05)。见图3、表2。

图1 各组炎症浸润及纤维化情况(×400)

图2 各组Tunel染色情况(×400)

图3 Western印迹检测PDGFRα、PDGFRβ、p-PDGFRαβ、p-AKT、p-ERK蛋白表达

组别 p-PDGFp-AKTp-ERKSham组1.00±0.081.0±0.141.0±0.12PQ组4.12±0.341)2.2±0.191)1.9±0.191)PQ+NIB组1.32±0.112)1.42±0.062)1.3±0.082)

3 讨 论

PQ被摄入后可造成体内多脏器功能损害〔4〕。PQ能够在肺组织中高浓度蓄积，以肺纤维化和神经损害表现最常见〔5〕。急性肺泡炎，大量炎症细胞浸润，肺部水肿，肺泡壁增厚为PQ中毒后早期的肺部表现；中晚期则表现为肺间质内大量纤维化生成〔6〕。PQ造成的肺损伤的主要机制包括：(1)PQ抑制抗氧化酶的生成与活性，导致自由基生成及脂质过氧化增多，从而加重氧自由基对肺组织的损伤；(2)PQ能够促进大量的炎症细胞增殖、浸润，炎症细胞分泌大量的炎症因子破坏肺泡上皮细胞，成纤维细胞大量激活，肺间质内纤维化增加；(3)氧自由基大量生成及DNA损伤诱导细胞凋亡，从而影响肺功能〔7〕。NIB靶向作用于靶向成纤维细胞生长因子(FGFR)1、2、3，PDGFRα和PDGFRβ及血管内皮生长因子受体(VEGFR)1、2、3受体，目前主要用于治疗特发性肺纤维化〔2〕。研究表明NIB具有抗凋亡〔8〕、抑制炎症〔9〕、抗增殖，抗纤维化〔10〕等生物学作用。本实验通过HE染色结果显示NIB通过减少炎症细胞的浸润发挥一定的抗炎作用，同时肺中炎症因子IL-1β和TNF-α浓度降低，减轻了炎症反应。 有报道〔11〕PQ造成小鼠炎症细胞浸润增加，并且基质金属蛋白酶(MMP)-2表达升高；同时炎症能导致蛋白酶大量释放与肺基质破坏、肺纤维化关系密切。因此抑制炎症能够减轻PQ导致的肺损伤。而在肺间质纤维化的过程中，PDGFRα和PDGFRβ的激活及自身磷酸化能够导致成纤维细胞的增殖和表型转化，促进肺纤维化的发生发展。本实验发现NIB能够抑制PDGFR磷酸化，并影响下游信号通路AKT及ERK的磷酸化来发挥抗凋亡和抗纤维化的作用，从而保护PQ导致的肺损伤。综上所述，NIB可以通过抑制炎症细胞的浸润，炎症因子的产生，抗细胞凋亡，抑制PDGFR/AKT/ERK信号通路抗纤维化等多个途径改善PQ对老年小鼠肺蛀损伤作用，减轻肺纤维化，减轻肺组织损伤，改善小鼠预后。