肺炎克雷伯菌致肝脓肿的临床和微生物学特征分析

林超 董郭枫 张思琴 田学斌 周翠 张秀彩 张艺之 曹建明 周铁丽

肺炎克雷伯菌作为肠杆菌科的成员之一，是引起社区和医院获得性感染不可忽视的潜在病原体，目前已成为仅次于大肠埃希菌的第二大条件致病菌，可使免疫功能受损的患者发生肺炎、尿路感染、菌血症和脑膜炎等多种感染[1]。在过去的20年中，在健康和免疫力低下的人群中出现了一种与普通肺炎克雷伯菌不同的肺炎克雷伯菌，即伴有高黏表型的新高毒力肺炎克雷伯菌[2]，可使健康的年轻个体发生肝脓肿等侵袭性感染，并可从原发感染部位播散侵袭到其他器官，一旦发生侵袭性播散，患者常伴有严重且不可逆的难治性后遗症[2-3]。据统计，由肺炎克雷伯菌所致的细菌性肝脓肿占肝脓肿的43%～66%[4]，患者常表现为发热、寒战、肝肿大及肝区疼痛等全身脓毒性反应，还可出现肝外侵袭综合征，甚至并发血流感染。肝脓肿患者的中毒症状严重，若脓肿引流不彻底，抗菌药物使用不及时，患者通常难以治愈[3]，严重威胁患者的健康甚至生命，因此临床工作者应高度重视。目前，肺炎克雷伯菌发挥致病性的主要毒力因子为荚膜、脂多糖和铁载体[5]。其中，K1和K2血清型是高毒力肺炎克雷伯菌最常见的荚膜血清型，类黏蛋白表型调节基因A（rmpA）是激活荚膜生成，导致菌株产生高黏表型且毒力增强的重要调节因子[6]，气杆菌素铁载体是肺炎克雷伯菌毒力增强的重要因素[7]。本研究回顾性分析163例肺炎克雷伯菌肝脓肿患者的临床特征，并探讨肺炎克雷伯菌的的微生物学特征，旨在为临床肝脓肿的诊治提供依据。

1 资料和方法

1.1 一般资料 回顾2016年1月至2017年12月温州医科大学附属第一医院收治的163例肺炎克雷伯菌肝脓肿患者的临床资料。细菌性肝脓肿诊断标准：具有临床特征（发热、寒战、腹痛、腹胀等），影像学（B超或CT）检查结果符合肝脓肿影像学特征，微生物培养（脓液或血液）结果证实病原菌为肺炎克雷伯菌。根据中华人民共和国卫生部《医院感染诊断标准（试行）》[8]判断感染类型：无明确潜伏期的感染，入院48h后发生的感染为医院感染，48h以内发生的感染为社区感染。肝脓肿治疗疗效判断标准[9]：临床症状、体征消失，脓肿缩小≥50%为显著有效；临床症状、体征改善，脓肿缩小＜50%为有效；临床症状、体征无改善，脓肿无缩小为治疗无效。

1.2 菌株鉴定 对分离出的163株肺炎克雷伯菌临床菌株（已剔除同一患者相同部位重复分离的菌株）分别接种到哥伦比亚血琼脂平板，在37℃培养箱中孵育18～24h；挑取单个纯菌落，在无菌机用生理盐水中调成0.5 麦氏单位（约 1.5×108CFU/ml）浊度的细菌悬液，采用VITEK 2型全自动微生物分析仪对其进行鉴定确认。

1.3 拉丝试验 将分离出的163株肺炎克雷伯菌临床菌株接种至哥伦比亚血琼脂平板，置37℃培养箱中孵育18～24h，用接种环在单个菌落表面轻轻接触并向侧面牵拉，如黏液丝形成且长度＞0.5cm，判断为阳性[10]。

1.4 药敏试验 将分离出的163株肺炎克雷伯菌临床菌株分别接种于哥伦比亚血琼脂平板，在37℃培养箱孵育18～24h；挑取单个纯菌落，在无菌机用生理盐水中调至 0.5 麦氏单位浊度（约 1.5×108CFU/ml）的菌悬液，加菌悬液至药敏检测卡，随后于VITEK 2型微生物分析仪上机分析，从而获得肺炎克雷伯菌对临床常用抗菌药物的药敏结果，药敏试验结果参照美国临床实验室标准化协会CLSI 2017标准[11]进行判读。

1.5 毒力基因和荚膜血清型检测 采用PCR扩增法检测细菌毒力基因和荚膜血清型。将已培养好的肺炎克雷伯菌置于装有400μl去离子水的离心管中，100℃加热15min，然后冰浴 10min，再 12 000g离心 5min，最后提取肺炎克雷伯菌DNA模板。PCR扩增毒力基因rmpA和气杆菌素，血清型 K1、K2、K5、K20、K54、K57。引物参照文献[12-13] 合成，见表1。PCR产物经1%琼脂糖凝胶电泳，GelRed染色后凝胶成像观察结果，阳性产物送至华大基因公司测序，序列经Blast和NCBI数据库进行比对确认。

表1 毒力基因和荚膜血清型引物序列

1.6 统计学处理 采用SPSS 17.0统计软件。计数资料以频数或百分率表示，组间比较采用χ2检验。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 163例肝脓肿患者的一般资料和临床特征 肺炎克雷伯菌引起的肝脓肿主要见于50岁以上的中老年患者，88.9%的患者具有发热症状，49.7%的患者伴有糖尿病，见表2。

表2 163例肝脓肿患者的一般资料及临床表现[例（%）]

2.2 拉丝试验结果 结果显示，163株肺炎克雷伯菌中50株菌株为阳性，提示具有高黏表型。

2.3 两种类型肺炎克雷伯菌的耐药情况 对临床常用的抗菌药物（哌拉西林/他唑巴坦、氨苄西林/舒巴坦、氨曲南、头孢他啶、头孢替坦、亚胺培南、厄他培南、头孢曲松、头孢吡肟、庆大霉素、妥布霉素、阿米卡星、环丙沙星、左氧氟沙星、复方新诺明），50株高黏表型肺炎克雷伯菌菌株中的耐药率均＜7%，113株非高黏表型肺炎克雷伯菌菌株的耐药率均＜13%，见表3。

表3 两种类型肺炎克雷伯菌对抗菌药物的耐药情况[株（%）]

2.4 两种类型肺炎克雷伯菌毒力基因和血清型分布情况 具有高黏表型的50株肺炎克雷伯菌均携带rmpA基因，携带率为100%，44株携带气杆菌素，占88.0%（44/50）；K1、K2、K5、K20 血清型分别为 18 株、19 株、3株和1株，其中9株未分型，未检到K54、K57血清型（图1）。非高黏表型菌株毒力基因rmpA和气杆菌素的检出率分别为92.9%和84.1%。高黏表型肺炎克雷伯菌K2型显著多于非高黏表型菌株，差异有统计学意义（P＜0.05）。两组菌株毒力基因携带率差异无统计学意义（P＞0.05）。见表 4。

图1 毒力基因及荚膜血清型分型电泳结果（M：Marker；N：阴性对照）

2.5 不同毒力基因、荚膜血清型、治疗方法患者的预后情况 163例肺炎克雷伯菌致肝脓肿患者中经治疗后好转116例，治疗无效47例。两组患者间毒力基因和荚膜血清型携带差异均无统计学意义（均P＞0.05），但采取引流的患者治疗好转率显著高于未引流患者（P＜0.05）。见表5。

表4 两种类型肺炎克雷伯菌毒力基因和荚膜血清型分布情况[株（%）]

3 讨论

肝脓肿为临床常见的疾病，其主要的临床症状为发热、寒战、腹痛、恶心及呕吐等全身脓毒性反应，均为非特异性症状。有研究表明，肺炎克雷伯菌为肝脓肿的主要致病菌[3]，且肺炎克雷伯菌引起的肝脓肿常见于60～70岁患者[14]。本研究结果显示，肺炎克雷伯菌引起的肝脓肿主要见于50岁以上患者，其中46%的患者年龄≥65 岁；88.9%的患者伴有发热，81.0%的患者伴有畏寒、寒战，与文献报道基本一致。这些症状出现的时间较早，但由于其为非特异性症状，不能及时诊断为肝脓肿，导致无法尽早治疗，从而影响患者康复。同时，本研究中49.7%的患者具有糖尿病基础疾病，分析原因可能是糖尿病患者的免疫功能相对较差，使病原菌更易入侵机体，对病原菌的抵抗力也相对较弱。

有研究表明，肺炎克雷伯菌对常用抗菌药物的耐药率呈现上升趋势[15]。本研究发现肝脓肿肺炎克雷伯菌对临床常用抗菌药物的耐药率较低，但长期以来，碳青霉烯类药物作为治疗肺炎克雷伯菌感染有效的抗菌药物之一，近年来耐药菌株开始出现，导致碳青霉烯类药物的治疗效果有所减弱，在本研究中分离自肝脓肿肺炎克雷伯菌对亚胺培南的耐药率为3%，提示我们需关注高毒力且耐碳青霉烯类肺炎克雷伯菌的传播，以免给临床治疗带来更大的困难。

有研究显示高毒力菌株内rmpA基因的携带率接近100%[16]，证明rmpA与高毒力肺炎克雷伯菌具有显著的相关性。同时，气杆菌素是肺炎克雷伯菌铁载体中最重要的铁载体系统[17]，是肺炎克雷伯菌毒力增加的重要因素。因此携带rmpA和气杆菌素的肺炎克雷伯菌通常具有高毒力。目前，肺炎克雷伯菌中K1和K2是高毒力肺炎克雷伯菌最常见的荚膜血清型[13]。本研究中高黏表型菌株与非高黏表型菌株毒力基因rmpA和气杆菌素携带率无明显差异，rmpA携带率均＞90%，气杆菌素携带率均＞80%；高黏表型菌株K1荚膜血清型分布显著少于非高黏表型菌株（P＜0.05），高黏表型菌株血清型均以K1和K2型常见，非高黏表型菌株血清型以K1型常见。基于以上结果，笔者发现不论是否具有高黏表型，这些肝脓肿肺炎克雷伯菌几乎都具有高毒力，因此，笔者推测判断高毒力菌株不能仅以高黏表型为判断标准，现已有研究表明高黏表型与高毒力并不是完全相关，携带rmpA和气杆菌素的菌株即使不具有高黏表型也具有高毒力[18]。因此，在临床治疗过程中不能因为患者感染的肺炎克雷伯菌为非高黏表型菌株而认为其毒力较低而轻视这些患者的治疗，需结合临床症状及时对患者进行有效治疗。

本研究中163例患者均进行了抗菌药物治疗，其中进行引流治疗135例，未进行引流治疗28例，经引流治疗的患者好转率明显高于未进行引流治疗的患者（P＜0.05），因此，可认为引流治疗是肝脓肿治疗的重要有效手段。笔者推测患者预后与患者基础疾病、自身免疫力、所使用的抗菌药物、是否引流等多种因素有关，其中引流是否及时是一个重要影响因素。

表5 不同毒力基因、荚膜血清型、治疗方法患者的预后情况[株（%）]

综上所述，肺炎克雷伯菌肝脓肿常见于中老年患者，对常用抗菌药物的耐药率低，但已出现多重耐药菌株，需引起高度关注，防止多重耐药的高毒力肺炎克雷伯菌的扩散；同时本研究发现菌株即使不具有高黏表型，但也可能具有高毒力；一旦发现肝脓肿患者，应密切关注其临床表现，制定合理的治疗方案，及时使用抗菌药物和进行引流治疗，从而提高患者的好转率/治愈率。