不同光敏剂对口腔常见致龋菌体外抗菌作用的比较研究

武韬 肖燕 周唯 方明 陈吉华

致龋菌是导致龋病发生和发展的最重要因素。口腔常见致龋菌包括变异链球菌、嗜酸乳杆菌、黏性放线菌等［1］。对致龋菌的有效杀灭或抑制生长，是控制龋病发生发展的重要手段。

光动力疗法是利用光敏剂在光照条件下发生光动力反应，通过产生的单线态氧与自由基破坏细菌正常结构，从而发挥抗菌作用的一类治疗方法。因其具有杀菌效率高、选择性强，且不易产生耐药性的特点，被逐渐用于口腔细菌和真菌感染的治疗［2-3］。

光敏剂在光动力疗法中作为能量的载体，其性能决定了光动力抗菌作用的强弱。本实验选用6种在光动力疗法中广泛应用，生物相容性好的小分子光敏剂，通过比较它们在牙科LED光固化灯照射及无光照条件下对口腔常见致龋菌的体外抗菌作用，以期筛选得到合适的光敏剂与应用剂量，为光动力疗法在龋病防治中的应用奠定实验基础。

1 材料与方法

1.1 主要材料、试剂以及仪器

脑心浸液肉汤（brain heart infusion broth，BHI）、脑心浸液琼脂（brain heart infusion agar，BHA）（青岛海博生物）；实验所用光敏剂：玫瑰红、赤藓红、甲苯胺蓝、亚甲基蓝、核黄素、姜黄素，对照组：醋酸氯己定（Sigma-Aldrich，USA）；高压锅（MLS-380，三洋，日本）；移液器（Eppendorf，德国）；二氧化碳恒温孵箱（HF151）、生物安全柜（1200，上海力康公司）；厌氧培养箱（H85，DWS，英国）；48孔板（3548，Corning，USA）；牙科LED光固化灯（Elipar，波长430～480 nm，3M，USA）。

1.2 受试菌株和培养条件

变异链球菌（UA 159）、嗜酸乳杆菌（ATCC 4356）和黏性放线菌（ATCC 15987）均采用BHI培养基进行培养，在37℃厌氧环境（80%N2、10%CO2、10%H2）中孵育24～48 h。

1.3 各组试剂的配制

避光称取0.011 g玫瑰红，于锡箔纸包裹的15 ml离心管中，然后加入无菌水10 ml，充分震荡摇匀，使其制成1 mmol/L玫瑰红母液，采用二倍稀释法，用无菌的BHI液倍比稀释配置浓度分别为：64、32、16、8、4、2、1、0.5和0.25μmol/L的溶液。称取0.044 g赤藓红用同样的方法配置1 000、500、250、125、62.5、31.25和15.625μmol/L的溶液。分别称取0.037 4 g甲苯胺蓝与0.032 g亚甲基蓝采用同样方法配制100、50、25、12.5、6.25、3.125、1.563和0.782μmol/L的溶液。分别称取0.188 2 g核黄素和0.184 2 g姜黄素采用同样方法配制10、5、2.5、1.25、0.625、0.312和0.156 mmol/L的溶液。称取0.064 g醋酸氯己定采用同样方法，配制100、50、25、12.5、6.25、3.125、1.563和0.782μmol/L的溶液。

1.4 最小抑菌浓度（MIC）和最小杀菌浓度（MBC）测试

取上述玫瑰红、赤藓红、甲苯胺蓝、亚甲基蓝、核黄素、姜黄素、醋酸氯己定各浓度的溶液1 ml加入48孔板中，每种光敏剂或者醋酸氯己定的每个浓度分为光照组与非光照组两组，每组各加入3孔。据此方法依次将不同浓度光敏剂与醋酸氯己定溶液加入各个平板中。变异链球菌、嗜酸性乳杆菌、黏性放线菌经传代培养后用比浊仪配制成0.5麦氏单位菌悬液，然后10倍稀释，此时菌浓度约1×107CFU/ml。设置以无添加光敏剂的无菌BHI培养基作为空白对照组，以无光敏剂的接种菌液的BHI培养基作为阴性对照组。

光照组、不光照组与阴性对照组各孔分别接种5 μl菌悬液，空白对照组用5μl无菌的BHI液代替，各培养板用锡箔纸包好置厌氧培养箱中避光孵育5 min，以增加细菌对光敏剂的摄取。

取出所有实验组与对照组，用牙科LED光固化灯分别对光照组每一个加样孔照射30 s，照射时光固化灯底端距离液面约5 mm。之后将所有实验组与对照组避光厌氧孵育，变异链球菌孵育24 h，嗜酸性乳杆菌和黏性放线菌孵育48 h。

培养结束后，菌液经过充分震荡混匀在暗背景下，肉眼观察微孔内液体清亮无浑浊或无沉淀生长的最低药物浓度即为该菌的最小抑菌浓度（minimal inhibitory concentration，MIC）。从清亮的孔中取20μl接种于BHA平板中，放入37℃厌氧孵箱中培养24 h。无细菌生长的最低浓度即为该菌的最小杀菌浓度（minimal bactericide concentration，MBC）。所有实验组与对照组所有菌种的MIC及MBC测定实验均重复3次。

1.5 统计学方法

应用SPSS 17.0统计软件对各组光敏剂实验组、非光照组与对照组的MIC、MBC值进行Kruskal-WallisH检验，双侧检验水准α=0.05。

2 结 果

不同光敏剂在光照及非光照条件下对口腔常见致龋菌的MIC及MBC结果如表1。光敏剂在光照下对常见口腔致龋菌均表现出不同程度的抗菌活性，玫瑰红、甲苯胺蓝、亚甲基蓝MIC及MBC较低，其中甲苯胺蓝对3种细菌的MIC范围在6.25～25μmol/L，MBC范围在12.5～100μmol/L。玫瑰红对3种细菌的MIC范围在0.5～2μmol/L，MBC范围在0.5～4 μmol/L。亚甲基蓝对3种细菌的MIC范围在1.56～25μmol/L，MBC范围在12.5～100 mol/L。其余光敏剂组：玫瑰红＞亚甲基蓝＞甲苯胺蓝＞赤藓红＞姜黄素＞核黄素。核黄素对3种致龋菌的MIC：10 mol/L，MBC＞10 mol/L没有表现出明显的抗菌性。

各组光敏剂对实验菌在不进行LED光照情况下。除玫瑰红组外对实验菌株的MIC与MBC相比于光照组无显著差异（P＞0.05）。而玫瑰红在不进行光照情况下对3种实验菌株的MIC范围为1～4μmol/L，MBC范围为1～8μmol/L。抗菌能力低于光照组。

光固化灯光照30 s可以增强玫瑰红的抗菌活性，尤其对于嗜酸乳杆菌和黏性放线菌的抗菌活性甚至超过氯己定（P＜0.05），光照组玫瑰红MIC、MBC低于甲苯胺蓝、亚甲基蓝（P＜0.05），光动力抗菌作用最强。

表1 不同光敏剂在非光照及光照条件下对口腔常见致龋菌的抗菌活性比较（MIC/MBC）Tab 1 Antimicrobial activity of different photosensitizers against common oral cariogenic bacteria with or without irradiation

3 讨 论

龋病患病率在我国一直居高不下［4］。致龋菌是导致龋病发生的重要因素。对致龋菌的抑制是预防和控制龋病的发生发展的有效措施，而光敏剂介导的光动力疗法具有显著的广谱抗菌作用。本研究选择了6种常见的小分子光敏剂，以3种口腔常见致龋菌为对象，检测光敏剂的抗菌作用。其中变异链球菌是口腔菌斑形成的促进因素［5］，也是最主要的致龋菌；嗜酸性乳杆菌具有产乳酸能力，与龋损的形成有密切关系；黏性放线菌是构成口腔内龈下菌斑的主要细菌，同时参与根面龋的发生［6］。

光动力疗法通过光敏剂产生的单线态氧与自由基发挥抗菌作用，其作用效果取决于光敏剂种类、光源的选择以及光照时间。光敏剂在光化学反应中作为能量的载体是反应过程中最不可或缺的部分。它的性能决定了起到光动力杀菌效应的活性氧族的产率。以往光动力疗法的研究多使用特制的激光光源，且照射时间长，本实验中使用临床中常用的牙科LED光固化灯作为引发光动力效应的光源，光照时间仅为30 s，筛选更适于口腔临床应用的小分子光敏剂。

本实验中，除外核黄素，几种光敏剂在不进行光照的情况下均有一定的抗菌能力。核黄素发挥光动力效应相关研究因应用光氧化交联胶原原理治疗圆锥角膜而被熟知，但有研究表明核黄素在蓝光LED照射下对放线共生放线杆菌、粪肠球菌等也能发挥光动力抗菌效应［7］。该研究中，虽光照波长在其吸收波长范围内，但因为本实验采取的光照时间较前人研究［8-9］（1 min至30 min不等）更短（30 s）。实验结果中未体现出核黄素的光动力抗菌活性。而姜黄素为植物提取物，近年来被报道应用于肿瘤的光动力治疗中，能有效抑制宫颈癌细胞的增殖［10］，并有体外实验研究表明其在蓝光LED下照射5 min对唾液内的变异链球菌具有抑菌性［11］，Mahdi等［12］研究表明甲苯胺蓝同赤藓红在蓝光照射下均有对嗜酸乳杆菌的杀灭作用。该研究中，姜黄素与赤藓红在光照或不光照时抗菌能力都较弱并且MIC与MBC未因光照而下降。甲苯胺蓝与亚甲基蓝作为最早应用于临床的光动力抗菌药物，属于吩噻嗪类，二者均有较高的单线态氧产率［13］。文献报道甲苯胺蓝具有很高的细菌细胞膜结合率，定位在细胞膜后，经过照射能迅速将细菌杀死［14］。Nada等［15］的研究表明甲苯胺蓝在LED照射下能有效杀死变异链球菌，同时具有一定暗毒性，在未光照情况下，对变异链球菌也有一定的抗菌能力，与本研究结果一致。但实验结果表示，这两种光敏剂抗菌能力并未因光照而增强。推测可能是因为这几种光敏剂最敏感的波长范围并不在实验所用光源范围（430～480 nm）内，如赤藓红为520～530 nm，甲苯胺蓝与亚甲基蓝为625～635 nm，姜黄素为405 nm［16］，同时有研究表明光动力抗菌效果随光照功率上升而增强［17］。牙科LED灯波长范围较激光或特制LED灯更宽，相同光强下，特定波长光的能量相对较低，所以上述几种光敏剂应用实验光源并没有体现明显的光动力抗菌作用。但牙科LED灯作为光动力疗法光源，不仅便于临床应用，更能避免热效应对周围组织的损伤［18］。能在便于临床应用的条件下短时间内发挥光动力抗菌效应。

虽然几种光敏剂除核黄素外均具有一定的暗毒性，在龋病防治中能起到一定效果，但评价光敏剂光动力抗菌效果重要的一点是所选用的光敏剂应当在受到光照射时增强光动力抗菌作用。而经过光照后，只有玫瑰红对三种细菌的MIC、MBC较不光照组更低。玫瑰红是一种氧杂蒽类光敏剂，具有良好的生物安全性，有学者使用牙科光固化灯作为激发光源，在悬浮的牙龈卟啉单胞菌形成生物膜后进行30 min光照处理，在牙龈卟啉单胞菌死亡的情况下，PDT的作用不会引起成纤维细胞的损伤［19］。本实验结果不仅表明光照增强了玫瑰红的抗菌性，而且能在较短的时间内发挥光动力抗菌作用，且抗菌效果明显优于其他各个组，具有较强的光动力抗菌性。但其对龋病的治疗效果还需要更多的临床实验研究，以期为抑制致龋菌进而控制龋病发生发展提供新的思路。

4 结 论

在受试光敏剂中，无论是否光照，玫瑰红对3种口腔常见致龋菌的抗菌作用均最强，与氯己定相当。牙科LED光固化灯光照30 s可以增强玫瑰红的抗菌活性，而对其他光敏剂抗菌效果的改变不明显。玫瑰红介导的光动力疗法具有用于龋病防治的良好前景。