EB病毒基因片段表达水平与鼻咽癌发病的关系

刘洁琼 曹永清 李科 齐慧

[摘要] 目的 探讨BCRF-1 mRNA表达水平与鼻咽癌发病相关性及其对免疫功能的影响。 方法 选取2017年1月～2018年5月于长沙市第一医院（以下简称“我院”）就诊的54例鼻咽癌患者（鼻咽癌组）作为研究对象，选取我院同期就诊的50例非肿瘤性鼻咽患者作为对照组。采用实时荧光定量PCR检测BCRF-1 mRNA的表达水平，采用流式细胞术检测T淋巴细胞亚群。 结果 与对照组比较，鼻咽癌组BCRF-1 mRNA相对表达显著升高（P < 0.05）;TNM分期T3～T4期、N2～N3期鼻咽癌BCRF-1 mRNA相对表达量明显高于T1～T2期、N0～N1期（P < 0.05）;BCRF-1 mRNA高表达组CD4+T细胞比例和CD4+/CD8+明显低于BCRF-1 mRNA低表达组，而CD8+T細胞比例明显高于BCRF-1 mRNA低表达组（均P < 0.05）。 结论 BCRF-1 mRNA表达可能与鼻咽癌TNM分期T、N有关，同时其高表达对患者免疫功能有抑制作用。

[关键词] BCRF-1 mRNA;鼻咽癌;EB病毒;免疫功能;临床病理特征

[中图分类号] R730.231          [文献标识码] A          [文章编号] 1673-7210（2019）09（b）-0113-04

Relationship between the expression level of EB virus gene fragment and the pathogenesis of nasopharyngeal carcinoma

LIU Jieqiong   CAO Yongqing   LI Ke   QI Hui

Department of Hematology and Oncology， the First Hospital of Changsha， Hu'nan Province， Changsha   410005， China

[Abstract] Objective To explore the correlation of BCRF-1 mRNA expression with nasopharyngeal carcinoma and its influence on immune function. Methods A total of 54 patients with nasopharyngeal carcinoma （nasopharyngeal carcinoma group） who were admitted to the First Hospital of Changsha （“our hospital” for short） from January 2017 to May 2018 were enrolled in the study. At the same time， 50 cases of non-neoplastic nasopharyngeal patients treated at the same time in our hospital were selected as the control group. The expression of BCRF-1 mRNA was detected by real-time PCR， the T cell subsets were determined by flow cytometry. Results Compared with control group， the relative expression of BCRF-1 mRNA was significantly increased （P < 0.05）. And the relative expression of BCRF-1 mRNA in TNM stage T3-T4 and N2-N3 was significantly higher than that in TNM stage T1-T2 and N0-N1 stage （P < 0.05）. The percentage of CD4+ T cells and CD4+/CD8+ in the high expression of BCRF-1 mRNA group was significantly lower than that in the low expression of BCRF-1 mRNA group， while the proportion of CD8+ T cells was significantly higher than that in the low expression of BCRF-1 mRNA group （all P < 0.05）. Conclusion The expression of BCRF-1 mRNA are may be related to TNM stage T and N of nasopharyngeal carcinoma， and its high expression can inhibit the immune function of patients.

[Key words] BCRF-1 mRNA; Nasopharyngeal carcinoma; EB virus; Immune function; Clinicopathological features

流行病学研究证实，我国部分地区2010～2016年鼻咽癌的发病可达283/10万人～482/10万人[1]。临床上鼻咽癌能够导致远处转移的发生，增加肿瘤患者的病死率风险，缩短患者总体生存时间[2-3]。在探讨鼻咽癌发病机制的过程中发现不同的基因或者肿瘤相关蛋白的表达，能够通过影响鼻黏膜上皮细胞的生物学特征，干预自身免疫监察作用，进而影响鼻咽癌发生发展的过程。EB病毒基因片段（BCRF-1）是EB病毒的重要开放编码阅读区，其能够通过编码VIL-10蛋白，进而导致鼻黏膜上皮细胞周期紊乱、加剧上皮细胞核DNA持续性异常扩增[4-5]。部分研究者探讨了BCRF-1 mRNA在鼻咽癌患者中的表达情况，认为BCRF-1 mRNA表达的增加与鼻咽癌的早期发生密切相关[6]，但缺乏对于BCRF-1 mRNA的表达与鼻咽癌患者自身免疫功能关系的研究。为了揭示BCRF-1 mRNA的表达与鼻咽癌发生发展的关系，从而为临床上鼻咽癌的诊疗提供理论方面的参考，本研究探讨了BCRF-1 mRNA的表达及其与鼻咽癌患者病情的关系，报道如下：

1 资料与方法

1.1 一般资料

选取2017年1月～2018年5月长沙市第一医院（以下简称“我院”）收治的鼻咽癌患者54例（鼻咽癌组）作为研究对象。纳入标准：①均经病理检查确诊;②患者及家属知情同意;③鼻咽癌组患者病理诊断符合《中国常见恶性肿瘤诊治规范》[7]中关于鼻咽癌的诊断标准。排除标准：①合并其他恶性肿瘤;②既往有免疫系统疾病或近期服用过影响免疫系统的药物;③研究前有放化疗等抗肿瘤治疗。选取我院同期就诊的非肿瘤性鼻咽患者50例作为对照组。两组受试者性别、年龄比较，差异无统计学意义（P > 0.05），具有可比性。见表1。本研究获得我院伦理委员会批准。

表1   两组一般资料比较

1.2 分期标准

鼻咽癌的TNM分期按照中国鼻咽癌分期2017版与UICC/AJCC分期第8版标准[8]。T分期：Tx：原发肿瘤无法评估;T0：未发现肿瘤，但有EB病毒阳性且有颈转移淋巴结;T1：肿瘤局限于鼻咽，或侵犯口咽和/或鼻腔，无咽旁间隙受累;T2：肿瘤侵犯咽旁间隙和/或邻近软组织受累（翼内肌、翼外肌、椎前肌）;T3：肿瘤侵犯颅底骨质结构、颈椎、翼状结构和/或鼻旁窦;T4：肿瘤侵犯至颅内，有颅神经、下咽、眼眶、腮腺受累和/或有超过翼外肌的外侧缘的广泛软组织侵犯。其中T1期7例、T2期10例、T3期24例、T4期13例。N分期：Nx：无法评估区域淋巴结;N0：无区域淋巴结转移;N1：单侧颈部和/或咽后淋巴结转移（不论侧数，最大径≤6 cm，且位于环状软骨下缘以上区域）;N2：双侧颈淋巴结转移（最大径≤6 cm，位于且环状软骨下缘以上区域）;N3：颈淋巴结转移（不论侧数，最大径>6 cm和/或位于环状软骨下缘以下区域）。

1.3 实验方法

1.3.1 RT-PCR检测BCRF-1 mRNA表达  采集患者的外周静脉血，加入0.2 mL的氯仿，2～8℃冰冻离心机中离心（12 000 r/min，离心15 min，半径为10 cm），反复1次洗涤RNA，弃上清，在管底部可见乳白色沉淀物，加入1 mL 75%乙醇，0.1% DEPC水溶解。加入BCRF-1 mRNA和GAPDH的上下游引物、0.1% DEPC，使其终浓度均为20 pmol/μL，制备反应体系。RT-PCR扩增的条件与参数：48℃ 45 min，94℃ 2 min;94℃ 30 s，58℃ 60 s，68℃ 2 min 共40个循环;循环完毕后68℃延伸7 min。RT-PCR试剂盒购自宝生物技术有限公司（日本Takara）（批号：20110357）。BCRF-1基因引物上游5′-CAAGGACCAACTACAACC-3′，下游5′-TGCCTCTTCTTTAATTG-3′;内参GADPH引物上游5′-GGTGAAGCTCGGAGTCAACG -3′，下游5′-CAAAGTTGTCATGGATGHACC-3′。结果按照2-ΔΔCt的方式进行表达。

1.3.2 流式细胞术检测T淋巴细胞亚群  采集患者清晨空腹血5 mL，置于肝素钠抗凝管中，采用流式细胞仪双标法进行T淋巴细胞的检测。相关标记操作于5 mL抗凝管中进行，100 μL全血与CD4-FITC/CD8-PE抗体室温反应25 min，采用红细胞裂解液Optilyse C溶血素溶解红细胞，PBS液体洗涤3遍，每次5 min，生理盐水重新悬浮细胞，上机检测。（FACS calibur流式细胞仪购自美国BD公司，threg检测试剂盒购自罗氏检测公司，货号：20120387，稀释度：1∶500）。

1.4 统计学方法

采用SPSS 19.0软件进行统计分析，计量资料以均数±标准差（x±s）表示，采用t检验，计数资料采用χ2检验。以P < 0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 鼻咽癌组和对照组BCRF-1 mRNA表达水平比较

鼻咽癌组BCRF-1 mRNA相对表达量为（0.895±0.103），明显高于对照组（0.355±0.097），差异有统计学意义（t = 24.470，P < 0.05）。见图1。

M：Marker;1：对照组;2：鼻咽癌组

图1   鼻咽癌组与对照组BCRF-1 mRNA PCR产物电泳图

2.2 鼻咽癌组织中BCRF-1 mRNA表达与临床病理特征的关系分析

TNM分期T3～T4期、N2～N3期的鼻咽癌組织中BCRF-1 mRNA表达量明显高于TNM分期T1～T2期、N0～N1期（均P < 0.05）。见表2。

2.3 鼻咽癌患者中BCRF-1 mRNA的相对表达量与T淋巴细胞亚群的关系分析

依据本研究中患者BCRF-1 mRNA平均相对表达量，将鼻咽癌患者分为BCRF-1 mRNA高表达组（表达量>0.895）和BCRF-1 mRNA低表达组（表达量 ≤0.895）。与BCRF-1 mRNA低表达组比较，BCRF-1 mRNA高表达组CD4+T细胞、CD4+/CD8+比例较低，而CD8+T细胞比例较高（均P < 0.05）。见表3。

表3   不同BCRF-1基因表达鼻咽癌患者T细胞亚群比较（x±s）

3 讨论

在长期吸烟或者合并有相关家族史的患者中，鼻咽癌的发病风险较高，特别是在合并有EB病毒感染的人群中，鼻咽癌的发生率可进一步上升[9]。现阶段临床上通过手术或者放疗措施治疗鼻咽癌，其能够提高鼻咽癌的治疗水平，延长鼻咽癌患者的总体生存时间[10-12]。但长期的随访研究证实，鼻咽癌治疗后生存转归的改善仍然不明显，治疗后鼻咽癌患者的病情恶化速度仍然较快。而本研究对鼻咽癌发展过程中基因因素的探讨，有助于揭示鼻咽癌的发生机制，并为鼻咽癌患者的临床诊疗提供理论前提。

临床上鼻咽癌的发病机制仍不清楚，不同病理性因素的改变，均有提高鼻黏膜上皮细胞异常增殖的风险，导致癌细胞转录水平的改变。EB病毒感染在促进鼻咽癌的发生过程中发挥了重要的作用，其能够通过整合宿主细胞，增加鼻黏膜上皮细胞G1/S期的细胞比例，提高癌细胞的浸润和黏附能力。而BCRF-1 mRNA作为EB病毒的非编码开放阅读区，其能够通过分泌VIL-11蛋白，进而调控上皮细胞的增殖、凋亡及分化过程。相关的基础研究也证实，BCRF-1 mRNA的表达能够提高染色体DNA的扩增速度，并能够通过甲基化或者磷酸化的修饰，降低癌细胞增殖过程中的基因错配修复能力，促进癌基因的突变和癌细胞的扩增[13]。部分研究者探讨了BCRF-1 mRNA的表达与鼻咽癌患者生存预后的关系，发现BCRF-1 mRNA表达浓度的上升与鼻咽癌患者病死率或者总体生存时间密切相关[14]，但缺乏对于BCRF-1 mRNA的表达与鼻咽癌患者T淋巴细胞亚群的关系研究。

本研究显示，鼻咽癌组BCRF-1 mRNA的表达与对照组比较，浓度明显上升，提示了BCRF-1 mRNA的高表达能够参与鼻咽癌的病情过程。通过汇集不同的相关文献，笔者认为这主要与BCRF-1 mRNA以下几个方面的病理性作用有关[15-16]：①BCRF-1 mRNA的上升能够通过提高鼻黏膜上皮细胞内肿瘤信号通路的激活程度，激活AKT或者NF-κB，促进癌细胞的增殖;②BCRF-1 mRNA的上升能够影响到鼻黏膜上皮细胞周期，导致癌细胞快速跨越G0期的能力明显增加。杨璐等[17]研究者也认为，在鼻咽癌患者中，BCRF-1 mRNA的表达浓度可平均上升35%以上，特别是在中晚期鼻咽癌患者或者远期生存时间较短的患者中，BCRF-1 mRNA的表达可进一步上升。本研究在探讨相关因子与鼻咽癌患者临床病理特征的关系过程中，发现BCRF-1 mRNA的表达与鼻咽癌患者的TNM分期及淋巴结转移密切相关，TNM分期晚或者已发生淋巴结转移的患者，其BCRF-1 mRNA表达水平可明显上升，这主要是由于BCRF-1 mRNA的表达能够增加癌细胞浸润能力，提高鼻黏膜上皮细胞浸润深度，延长TNM分期;而BCRF-1 mRNA可以同时提高癌细胞对于锁骨下或者颈部淋巴结的黏附能力，促进淋巴结转移的发生。但部分研究者并不认为BCRF-1 mRNA的表达与鼻咽癌患者的淋巴结转移有关[18-20]，这与本研究存在一定的差别，主要考虑与BCRF-1 mRNA的检测灵敏度差别有关。最后本研究发现，BCRF-1 mRNA高表達组CD4+T淋巴细胞比例明显下降，而CD8+T淋巴细胞明显上升，提示BCRF-1 mRNA的表达与鼻咽癌患者的T淋巴细胞功能密切相关，这主要由于BCRF-1 mRNA能够导致自身免疫逃逸的发生，并影响到树突状细胞的抗原提呈功能，进而导致T淋巴细胞亚群的改变[21-22]。

本研究的创新性在于探讨了BCRF-1 mRNA的表达与T淋巴细胞亚群的关系。综上所述，在鼻咽癌患者中，BCRF-1 mRNA的表达明显上升，BCRF-1 mRNA的表达与患者TNM分期或者淋巴结转移密切相关，同时BCRF-1 mRNA的表达还能够影响到患者的T淋巴细胞功能。

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（收稿日期：2018-12-18  本文编辑：张瑜杰）