不同参数精子顶体酶活性与精子在IVF治疗中受精能力的关系研究

冯 星 叶 红 胡元波 汤佳楠 王志凯 孙予华 顾一骅 郑菊芬,,**

1.上海市计生所医院检验科（上海 200032）

2.上海市计划生育科学研究所，国家人口和计划生育避孕药具重点实验室（上海 200032）

3.海军军医大学第一附属医院生殖中心（上海 200433）

前 言

男性不育症发病率高，然而病因大多都不明确[1]，单精子卵胞浆内注射技术 （intracytoplasmic sperm injection，ICSI）的发明给男性不育症的治疗带来重大突破，但由于受精过程是将精子直接注射入卵子，因而无法观察到精子的自然受精结果，也就不能解决病因和诊断等问题。ICSI技术是无精子症和严重少弱精子症等严重男性不育症的首选治疗方法，但更多其他不育症希望能自然生育，其前提则是精子必须具备自然受精能力，所以，寻找有效的精子功能试验来辅助判断不同类型精子的受精能力是生殖男科重要的研究方向。常规体外受精技术（in vitro fertilization，IVF）虽然是用来治疗输卵管阻塞等女性不孕症问题，但由于能在体外直接观察到精子的受精结果，因而可以用来验证精子功能试验对受精能力的预测作用；特别时近年来使用的短时IVF[2]治疗既能观察到精子的受精结果，又能避免因完全不受精或低受精等对患者夫妇带来不良结果的伦理问题，为各项精子功能试验提供了操作性强又准确的临床验证方法。

顶体酶是位于精子头部的顶体内，是精子头部穿过卵子透明带完成受精过程中不可缺少的水解酶，也是自然受精的必需步骤。不少研究[3，4]发现精子顶体酶活性与精子参数和受精能力存在显著相关性，但精子参数受患者自身状态、检测设备型号和检测人员经验等诸多因素影响波动幅度较大[5-7]，而且诊断性检测手段通常与IVF治疗日会有几个月甚至更长的时间差。为了将患者和技术等影响因素降到最低水平，本研究将怀孕率排除在外，这样就可以减少对入组病例数量的要求以确保对每个IVF病例进行全程状态追踪随访，并只对近期完成IVF治疗的病例做顶体酶活性值测定，并利用体外受精结果来验证顶体酶活性值测定对不同参数精子受精能力判断的准确性，旨在为不同精子样本寻找更合适的精子功能试验作为受精能力判断的辅助诊断工具，以便让患者选择更合适的治疗方式，减少人力和财力的浪费。

材料与方法

一、研究对象和纳入标准

（一）研究对象

2016年12月～2018年9月期间在上海计生所医院门诊做精子顶体酶活性测定并在长海医院接受IVF或短时IVF治疗的不育症病例，共75例。

（二）纳入标准

1.医疗依从性良好并准备在近期接受IVF治疗的不育症病例：每次取精前全身状态良好，禁欲时间3～5d，取精时标本完整；在女方促排期间愿意接受并配合复查精液者；

2.精液分析结果入组标准：至少有两次相近精液检测结果，精液量≥1.0 mL，精子浓度≥10×106/mL，前向运动精子百分率≥10%，精子正常形态率≥3%，精液中白细胞＜1×106/mL；

3.有IVF不受精或受精不良史病例优先入组；

4.女方年龄小于40岁，成熟卵子数≥2个，病因为输卵管因素、多囊卵巢综合征或不明原因性不孕症；

5.男女双方染色体均正常。

二、研究方法

（一）男科临床医师全程随访

筛选入组病例并与之充分沟通，告知检测意义及需要配合的注意事项；在女方配偶促排卵当月对男方进行顶体酶检测，在IVF进周期间保持全程跟踪随访，并及时处理突发事件如感冒等其他意外状况，尽量减少影响精子质量的外在因素；当顶体酶低于正常值或顶体酶值正常但精液参数处理前后不理想时给出短时IVF治疗建议。由于本文通讯作者既是男科临床医生同时又参与胚胎实验室工作，有便利条件严格选择入组病例并控制各项影响因素。

（二）精液分析

按照WHO第5版标准进行精液分析，禁欲2～7d之间采集精液，1h内行精液常规分析，并由具备胚胎实验室经验的男科临床医师同时做人工计数矫正；精子形态分析采用改良巴氏染色法进行，计数不少于200个精子，并由胚胎实验室医师复核。

（三）精子测定方法

采用Na-苯甲酰 -DL-精胺酸-P-硝酰基苯胺(BAPNA)法进行顶体酶活性测定[3]，使用天津瑞爱金生物科技有限公司的试剂盒和美谱达PV2的可见分光光度计。正常参考值为48.2～218.7 μIU/106个精子，低于48.2 μIU/106精子为低值。

顶体酶活性测定方法的质量控制：（1）精子浓度计数双人矫正；（2）倾倒精浆时要留意是否有精子的薄膜留在试管内；（3）精子要充分与反应液混匀,黏稠度高者需充分吹打；（4）反应温度要在24摄氏度水浴孵育；（5）临用前配制反应液，加完终止液离心后立即比色；（6）注意试剂批间差。

（四）IVF或短时IVF操作

采用控制性超排卵，以常规促性腺激素释放激素（gonadotrophin-releasing hormone agonist,GnRHa）、卵泡刺激素（follicle-stimulating hormone,FSH）、人绒毛膜促性腺激素（human chorionic gonadotropin,hCG）促排卵方案。常规IVF在取卵后3～4h将卵子加至制作好的受精滴中，加精后16～18h观察受精情况。短时IVF在取卵后1～2h将卵子加至制作好的受精滴中，加精后4～6h观察第二极体排出情况，当天即对第二极体排出不明显的卵子进行ICSI注射操作，受精后16～18h观察并记录受精情况。为减少卵子成熟度对受精的影响，本研究受精率统计分母为成熟卵子数而非总获卵数。

三、统计学分析

使用了SPSS 13.0软件来分析所得到的数据，计数数据用均值±标准差（x±s）表示，组间比较采用t检测，率的比较采用χ2检验，P＜0.05为差异具有统计学意义。

研究结果

一、一般临床资料

本研究共纳入IVF术前接受精子顶体酶活性测定病人 75 例，男方平均年龄（32.97±5.22）岁（25～51 岁），女方平均年龄（31.24±3.80）岁（23～39 岁），平均不育年限（3.80±2.31）年（0.5～11 年），其中男性继发性不育 28例，女性继发性不孕28例；不明原因原发性不育症例12 例。 精液参数：精液量（2.58±1.02）mL（1.0～5.0）mL、精子浓度（48.74±31.37）× 106/mL[（12～172）× 106/mL]、前向运动精子百分率（43.13±13.10）%(13～80%)、快速前向运动精子百分率（19.67±6.93）%(5～42%)；除 4 例精子正常形态率在临界状态外，其余精子形态均正常。3例临界形态精子处在顶体酶低值组，其中2例短时IVF不受精，1例IVF低受精；另外1例处在顶体酶正常值组，IVF受精率不到50%。由于有不良受精史和少弱精子症病例优先入组，所以总受精率较低为54.0%（343/635）,新鲜移植周期临床妊娠率 52.6%(20/38)。

二、按顶体酶值分组的结果比较

按顶体酶活性值分类，低于48.2 μIU/106个精子为低值组，高于48.2 μIU/106个精子为正常值组：低值组和正常值组不明原因性不孕不育分别7例和5例。两组的基本情况见表1，低值组男方年龄稍高于正常组（P＜0.01），两组的顶体酶活性值和精子浓度有显著差异（P＜0.01），但快速前向运动精子百分率和前向运动精子百分率均无显著差异，差异无统计学意义（P＞0.05）。顶体酶低值组的受精率显著低于正常值组（P＜0.01），低受精病例明显高于正常值组（P＜0.05），但完全不受精率仅比正常值组稍高 （P＞0.05）。正常值组完全不受精8例，卵子数均在6枚以上，没有低受精病例，呈现“全”或“无”的受精模式；低值组完全不受精13例，只有4例卵子数6枚以上，另有低受精5例，见表2。

表1顶体酶正常值组和低值组的基本情况

表2顶体酶正常值组和低值组的临床和实例数据比较

表3两种不同精子浓度组的基本情况

三、按精子浓度分组的结果比较

两组的基本情况见表3。按精子浓度分为低浓度组（10～35)×106/mL）和高浓度组（＞35 ×106/mL），两组组的精子浓度和顶体酶活性值存在显著性差异（P＜0.01），快速前向运动精子百分率和前向运动精子百分率也存在显著性差异（P＜0.01）。精子低浓度组的受精率显著低于高浓度组 （P＜0.01），低受精病例明显高于高浓度组（P＜0.05），但完全不受精率比正常值组稍低，无统计学意义（P＞0.05）。低浓度组中完全不受精14例（其中5例卵子数6枚以上），低受精5例；顶体酶异常占80.56%（29/36），其中不受精和低受精率为58.62%(17/29)。高浓度组完全不受精7例（卵子数均在6枚以上），没有低受精病例，呈现“全”或“无”的受精模式；顶体酶异常占12.8%（5/39），其中只有1例不受精，见表4。

表4两种不同精子浓度组的临床和实验数据比较

表5精子低浓度组中不同顶体酶组的基本情况

四、精子低浓度组再按顶体酶值分组结果比较

两组的基本情况见表5。精子低浓度组和顶体酶低值组的不受精率和低受精比例明显升高，特别是低受精情况更为显著，在精子低浓度组再按顶体酶正常值组和低值组分组发现：两组的精子浓度、前向运动精子百分率和快速前向运动精子百分率均无统计学差异（P＞0.05），但顶体酶活性值和受精率存在显著性差异（P＜0.01）：正常值组完全不受精2例，没有低受精病例；低值组完全不受精12例，低受精5例，其差异均无显著性（P＞0.05，见表 6）。

表6精子低浓度组中不同顶体酶组的临床和实验数据比较

讨 论

辅助生殖技术早期研究[8，9]就证实精子参数与受精结果相关性较强，而临床妊娠结局不受精子参数影响，却与女性配偶的年龄和生育状态相关性更强，所以本研究排除怀孕率统计可以大大减少入组病例数，这样更能集中精力做好IVF期间的随访追踪和各项质控工作，将研究重点关注在精子参数、顶体酶与受精能力的相关性上。顶体酶活性对IVF受精结果的影响一直存在着争议，国内大多研究[10，11]认为顶体酶活性与精子体外受精能力密切相关,顶体酶活性低下可能是导致受精失败的原因。但国外虽然在早期对顶体酶研究较多，近年来却有减少趋势，可能因大多研究[12，13]认为顶体酶活性与IVF受精结局无相关性，最近也有研究[14]认为精子顶体功能与受精能力有一定的相关性，但敏感性和特异性均不高。根据我们的经验推测这些不同结果可能与入组的精液参数标准和精液的质量控制体系密切相关，精子参数中形态学高畸形率影响顶体酶活性并导致受精能力下降的研究[15，16]结果较为一致，现行的严格标准形态学[17]可以作为独立的受精能力预测指标，但最大的缺陷在于不同实验室和不同检验人员的操作误差相当大，无法给出准确可靠的诊断依据；我们前期研究显示相似结果，所以本课题入组的大多为正常形态精子，只有4例精子形态学处于临界状态（3%），IVF受精结果都不理想：2例不受精，1例低受精，另1例受精率低于50%。同样道理，我们选择精子浓度≥10×106/mL，前向运动精子百分率≥10%的病例入组，因为比这些参数更差的精子选择IVF治疗后，其不受精或低受精病例的增多会显著提高阳性结果，但对较好精子却不一定有临床意义；而严重少弱畸形精子症精子由于自然受精能力极差，仅靠精液常规检测和形态学即可决定是否需要接受ICSI技术治疗，无需额外方法来辅佐。本课题对75例入组病例按顶体酶活性值分类，发现顶体酶低值组和正常值组的顶体酶活性值和精子浓度有显著差异，但快速前向运动精子百分率和前向运动精子百分率均无显著差异，该结果与少数研究[18]相一致；而大多研究[11，19]则认为除了精子浓度和形态外，与前向运动精子百分率也有显著差异，这可能与本课题排除严重少弱精子症入组有关。我们对精子浓度进行统计处理发现35×106/mL可作为分界线，再细分为低浓度组[（10～35）×106/mL和高浓度组（＞35×106/mL），两组的精子浓度和顶体酶活性值存在显著性差异，快速前向运动精子百分率和前向运动精子百分率也存在显著性差异。精子低浓度组的受精率显著低于高浓度组，主要是低受精病例明显多于高浓度组，但完全不受精病例仅比正常值组稍多无统计学意义，顶体酶异常占80.6%（29/36），其中不受精和低受精率为58.62%(17/29)；高浓度组精子顶体酶活性大多正常，出现“全”或“无”的受精模式，做顶体酶活性检测无法预防完全不受精的发生，该现象提示高浓度组与低浓度组精子不受精的原因可能存在差异，需要用另外受精途径研究解释。将精子低浓度组再按顶体酶值分组，顶体酶低值组的受精率显著低于顶体酶正常值组，而两组的精子浓度、活动力和不受精率均无显著性差异，这种情况提示了低浓度组的不受精或低受精可能与精子顶体酶活性下降直接相关；因而，对低浓度组精子有必要进一步做顶体酶活性检测，顶体酶低值者建议短时IVF治疗，能有效减少甚至避免不受精和低受精病例的出现。

与大多数精子功能试验一样，顶体酶活性值测定存在着因不同实验室的检测方法和质量控制体系不统一而导致结果可比性差的情况。为了加强质控系统管理，本研究在顶体酶测定时间的选择、患者精液检测注意事项宣教、精子浓度准确计数和顶体酶活性其他影响因素如精液中的白细胞水平[20]等各个环节都做了严格限定，但仍然不可避免存在患者依从性不一、精液检测技术水平差异和顶体酶试剂批间差等问题。

本研究通过严格精液质控和入组参数选择后发现，精子浓度比活动力与顶体酶活性更具相关性；在低浓度组通常伴有顶体酶活性的下降，提示低受精或不受精可能性的增大，选择短时IVF治疗能有效降低受精失败风险；而高浓度精子顶体酶大多正常，同时呈现“全”或“无”的受精模式，其不受精原因可能与顶体酶活性无关，这类病例无需常规做顶体酶活性测定。