抵抗素通过TLR4/MyD88依赖途径促进牛肺泡巨噬细胞炎症因子产生①

岳梦佳 左之才 阳明贤 李 碧 岑 垚 姚彩霞

(四川农业大学动物医学院，环境公害与动物疾病四川省高校重点实验室，动物疫病与人类健康四川省重点实验室，温江 611130)

抵抗素(Resistin,RETN)，是一种胰岛素的负调节物，通过拮抗肝脏、骨骼肌和脂肪等组织中的胰岛素减少机体对葡萄糖的吸收，在调节能量平衡和代谢中具有重要作用[1,2]。但近年来，大量研究发现抵抗素还具有强烈促炎作用，更被认为是一种促炎细胞因子[3]。研究表明，抵抗素可由中性粒细胞和巨噬细胞等炎性细胞大量分泌表达[4,5]，另外，抵抗素也可诱导IL-6、IL-1β和TNF-α等促炎细胞因子释放，促使巨噬细胞由抗炎的M2型向促炎的M1型表达调控炎症过程[6,7]。抵抗素的强烈促炎作用已被广泛认可，且越来越多研究显示炎症是一种高水平的抵抗素状态[8]，但其潜在的分子机制尚不清楚，有待进一步深入研究。

Toll样受体 (Toll like receptor,TLR) 作为连接天然免疫和获得性免疫的桥梁[9,10]，其介导的信号转导通路及其作用一直是科研人员研究的焦点。由髓样分化因子88 (Myeloid differentiation primary respo-nse protein 88,MyD88) 承接的转导途径称为MyD88依赖途径，其他称为MyD88非依赖途径[11]。当MyD88分子被激活后，募集下游IL-1受体相关激酶 (Interleukin-1 receptor associated kinas,IRAK)，经过一系列信号传导，最后活化核转录因子(Nuclearfactor kappa,NF-κB)[12,13]，导致促炎细胞因子IL-6、IL-1β、TNF-α等释放增加，放大炎症信号，诱发炎症反应。

抵抗素能与TLR4发生直接相互作用，与TLR4-MD2复合物结合，诱发机体炎症反应，在人单核白血病细胞(THP-1)上已得到证实[14]。然而，抵抗素的促炎作用及其细胞内的信号传导机制尚未完全阐明，且缺少牛肺泡巨噬细胞的相关研究。本试验基于抵抗素和TLR4信号通路在炎症和生理方面的重要作用，利用牛抵抗素处理牛肺泡巨噬细胞，检测TLR4/MyD88依赖途径信号通路相关基因(TLR4、MyD88、IRAK4、NF-κB)mRNA和蛋白表达量以及下游促炎因子IL-6、IL-1β和TNF-α表达水平，初步探讨抵抗素诱导条件下TLR4/MyD88依赖途径信号通路相关基因的表达变化规律，以期为后续炎症疾病的治疗提供新的思路。

1 材料与方法

1.1材料 高糖DMEM购自Hyclone公司；胎牛血清购自生工生物有限公司；Premix Taq酶、反转录酶试剂盒购自TaKaRa公司；牛抵抗素(四川农业大学动物医学院环境公害与动物疾病四川省高校重点实验室原核表达提取，且经内毒素去除试剂盒除去内毒素)；牛肺泡巨噬细胞采自健康牛新鲜肺部组织；IL-6、IL-1β和TNF-α ELISA检测试剂盒购自南京建成试剂有限公司；单克隆抗体β-actin (4790；Cst)，TLR4(NBP2-24538SS；Novus)，MyD88(70R-50098；Fitzgerald)，IRAK4(AP23599PU-N；OriGene)，P65(NBP2-24541SS;Novus)；TLR4、MyD88、IRAK4、NF-κB、β-actin的检测引物见表1，引物由上海生工生物有限公司合成。

1.2方法

1.2.1牛肺泡巨噬细胞的采集与分组 方法参照Xu等[15]实验方法，肺泡巨噬细胞阳性分离率大于96%。无菌并含有200 U/ml青霉素、200 μg/ml链霉素的PBS，经4℃预冷处理，保存备用。采取眼观无病变并保留10 cm以上气管的完整水牛肺部，结扎气管。PBS洗净肺表面，将适量PBS经气管灌入肺部，同时适当轻柔肺部，收集灌洗液，重复3次。灌洗液经200目纱布过滤，1 500 r/min离心10 min，收集细胞。PBS洗涤细胞，1 000 r/min离心10 min。用含胎牛血清100 ml/L的细胞培养液(胎牛血清与DMEM 按1∶9体积混合)重悬细胞，细胞计数，置于37℃、5%CO2孵育箱内培养细胞6 h。PBS洗去未贴壁细胞，消化重悬细胞，调整细胞数为1×106个/ml，通过台盼蓝染色法计算细胞存活率， 分装于6孔板中，置于细胞孵育箱内培养3 h。加终浓度为100 ng/ml 的抵抗素进行诱导，阴性对照添加等体积PBS，每组设置3个平行样。分别离心收集诱导0、1.5、3、6、12、24 h后的上清液和下层细胞，上清液用于检测IL-6、IL-1β和TNF-α 的含量，下层细胞用于检测TLR4、MyD88、IRAK4和NF-κB mRNA水平以及蛋白表达。

表1 各基因荧光定量引物

Tab.1 Primer sequence of genes for Real-time PCR

GeneSequenceAccession No.TLR4F:CCTAGCAAGAGCAGAGAACCAGAAGNM-174198.6R:GTCACTGGTGGCTTCTTCTTCACAGMyD88F:AGAAGAGGTGCCGTCGGATGGXM-005222379.3R:TTGGTGTAGTCACAGACAGTGATGAAGIRAK4F:CTGTGGATGAACACCGTGAACCTCNM-001075998.1R:GACACTGACTGGCAACAGAGTACATAGNF-κBF:GAGATCATCGAGCAGCCCAAXM-002695167.5R:ATAGTGGGGTGGGTCTTGGTβ-actinF:GCCCATCTATGAGGGGTACGAF 191490.1R:TCACGGACGATTTCCGCT

1.2.2实时荧光定量 PCR检测牛肺泡巨噬细胞TLR4、MyD88、IRAK4和NF-κB mRAN表达水平 采用Trizol法提取培养下层牛肺泡巨噬细胞总RNA，测定总RNA浓度及纯度。参照试剂盒说明书进行反转录，cDNA保存于-20℃。以cDNA为模板，对TLR4、MyD88、IRAK4、NF-κB 的mRNA表达量进行检测。cDNA进行10～105的10倍系列稀释，制作标准曲线。实时定量PCR反应体系：上游引物0.5 μl，下游引物0.5 μl，Premix Taq 6.0 μl，模板 5.0 μl。反应条件95℃ 3 min，95℃ 10 s，58℃ 30 s，循环40次，每个循环后检测荧光强度值。实时定量PCR的结果采用2-ΔΔCT法进行计算，用内参基因β-actin对各基因表达水平均一化，2-ΔΔCT法计算公式：ΔCT=CT目的基因-CT内参基因，ΔΔCt=ΔCT试验组-ΔCT对照组。

1.2.3Western blot法检测牛肺泡巨噬细胞中TLR4、MyD88、IRAK4、NF-κB等的蛋白水平 下层细胞加裂解液，煮沸5 min，14 000 r/min离心5 min；取离心后的样本上样(上样量为20 μg总蛋白)；电泳程序(S1：90 V，15 min；S2：120 V，至结束)，蛋白样品经电泳分离后，转至硝酸纤维素膜上(100 V，90 min)；加50 g/L脱脂牛奶室温封闭1 h后，与 1∶1 000稀释的兔抗TLR4 抗体、兔抗MyD88抗体、兔抗IRAK4抗体、兔抗NF-κB抗体、兔抗β-actin抗体，4℃孵育过夜；1×TBST洗膜5 min×3次后加入辣根过氧化物酶标记的山羊抗兔IgG (1∶5 000)，室温孵育1 h；1×TBST洗10 min×3次；增强化学发光法 (Enhanced chemiluminescent，ECL) 显色，曝光。

1.2.4ELISA检测牛肺泡巨噬细胞上清液中IL-6、IL-1β和TNF-α浓度 细胞上清离心，按照ELISA试剂盒说明书检测IL-6、IL-1β和TNF-α促炎细胞因子浓度。

2 结果

2.1抵抗素促进牛肺泡巨噬细胞TLR4、MyD88、IRAK4和NF-κB的mRNA表达 将每个基因阴性对照的0 h的表达量设置为1，对TLR4/MyD88依赖途径信号通路相关基因的Real-time PCR结果进行统计。结果发现，在100 ng/ml终浓度抵抗素诱导后，TLR4、MyD88、IRAK4、NF-κB mRNA表达量均明显增加，如图1。在抵抗素诱导后3 h，各基因变化均不显著，当诱导6 h后，各基因表达量均极显著升高(P< 0.01)，12 h 表达量最高。

图1 实时定量PCR检测牛肺泡巨噬细胞TLR4、MyD88、IRAK4 and NF-κB的mRNA表达水平Fig.1 Genes expression of TLR4,MyD88,IRAK4 and NF-κB in BAMs were tested by qRT-PCRNote: PBS.Represents negative control.**.P<0.01 vs PBS.

图2 Western blot法检测牛肺泡巨噬细胞TLR4、MyD88、IRAK4和NF-κB的蛋白表水平Fig.2 Proteins expression of TLR4,MyD88,IRAK4 and NF-κB in BAMs were analyzed by Western blotNote: PBS.Represents negative control.**.P<0.01 vs PBS.

图3 ELISA检测牛肺泡巨噬细胞后上清液IL-6、IL-1β和TNF-α的浓度Fig.3 Concentration of IL-6，IL-1β and TNF-α in supernatant were measured by ELISANote: PBS.Represents negative control.**.P<0.01 vs PBS.

2.2抵抗素上调牛肺泡巨噬细胞TLR4、MyD88、IRAK4和NF-κB蛋白表达 根据2.1中基因表达结果，采用免疫印迹法检测100 ng/ml抵抗素诱导12 h后TLR4、MyD88、IRAK4、NF-κB蛋白表达水平。结果如图2所示，与对照组相比，抵抗素可显著诱导牛肺泡巨噬细胞上述蛋白表达(P< 0.01)，与基因检测结果相符。

2.3抵抗素增加牛肺泡巨噬细胞IL-6、IL-1β和TNF-α的释放 采用ELISA试验对100 ng/ml抵抗素处理后各时间点细胞上清中IL-6、IL-1β和TNF-α等促炎因子进行检测，结果见图3。抵抗素诱导牛肺泡巨噬细胞1.5 h后，IL-6、IL-1β和TNF-α浓度极显著增高 (P< 0.01)，且表达量随诱导时间增加而增加，IL-6、TNF-α在12 h达到峰值。

3 讨论

抵抗素具有促炎效应，在炎症的发生和进程中具有重要调控作用。研究发现，抵抗素在许多炎性疾病中扮演着重要角色，参与炎性疾病的发生和恢复，在动脉粥样硬化[16]、关节炎[17]、全身炎症反应综合征[18]等炎性疾病过程中，均发现抵抗素处于高表达状态。此外，抵抗素水平与IL-1β、IL-6、TNF-α等促炎细胞因子含量正相关[19,20]。Gao等[21]通过小鼠实验发现抵抗素通过TLR4/NF-κB信号通路促进TNF-α、IL-1β等炎性细胞因子表达增强冠状动脉炎发展过程中的炎症反应。Jiang等[22]也发现，在大鼠胰腺腺泡细胞中，抵抗素可激活NF-κB刺激促炎细胞因子TNF-α和IL-6的产生，加重胰腺炎损伤和风险。在本次研究中，发现牛肺泡巨噬细胞经抵抗素诱导后，NF-κB的mRNA表达量于6 h极显著上调，Western blot 结果显示其蛋白水平在12 h也显著上调。通过检测细胞上清发现，在该过程中抵抗素以时间依赖效应促进IL-6、IL-1β、TNF-α等促炎细胞因子表达释放，IL-1β和TNF-α表达量于12 h 达到峰值。上述结果显示抵抗素可促进牛肺泡巨噬细胞IL-6、IL-1β、TNF-α等促炎细胞因子表达，该过程可能与激活NF-κB有关。Toll样受体是一类分布广泛，表达于多种细胞中的天然免疫受体，可非特异性结合病原相关分子，启动机体炎症反应，在免疫防御中起着重要作用[23]。其中，TLR4是最早被发现，且研究最深[24]，不仅可识别大多数病原微生物，并激发机体天然免疫系统，在炎性疾病中也起着重要调控作用[25,26]。研究显示，TLR4与抵抗素密切相关，且是抵抗素发挥促炎效应的潜在受体之一[27]。在动脉粥样硬化过程中，抵抗素通过TLR4激活NF-κB诱导IL-6和TNF-α表达，促进外周血单个核细胞(PBMCs)的炎症反应，加重疾病程度[28,29]。尽管抵抗素可通过TLR4发挥促炎作用，但其胞内信号传导途径却鲜有报道。基于此，我们研究发现牛肺泡巨噬细胞经抵抗素诱导6 h后，TLR4及下游信号分子MyD88和IRAK4的mRNA水平均极显著增加，12 h达到峰值，12 h TLR4、MyD88和IRAK4蛋白表达量较0 h均极显著上调。因此推测，TLR4/MyD88依赖途径可能是抵抗素发挥促炎作用的关键胞内信号通路之一。

综上所述，抵抗素可诱导牛肺泡巨噬细胞释放IL-6、IL-1β和TNF-α等促炎细胞因子，促进炎症反应，且此过程可能与TLR4/MyD88/NF-κB信号途径有关，提示该信号通路可能是抵抗素发挥促炎作用的重要分子机制之一。本试验初步探讨了抵抗素促进牛肺泡巨噬细胞炎症反应的分子机制，以期为肺部炎症疾病的预防及治疗提供新的方向和靶点。