APS复发性流产患者血小板的活化及其对内皮细胞的影响①

马寅芙 刘 磊 王起来 芦小单 孙牧男 林秀英 谭 岩 方艳秋

(吉林省人民医院生殖医学中心，长春 130021)

复发性流产(Recurrent spontaneous abortion，RSA)是常见的妊娠相关疾病，见于1%～3%的育龄妇女[1]。抗磷脂综合征(Antiphospholipid syndrome，APS)是一种发病涉及临床多学科的自身免疫性疾病，是引起复发性流产的常见病因。APS导致凝血、炎症和流产的确切机制尚未完全明了，血小板激活和内皮细胞活化是APS的重要病理过程，有效监控血小板活化的发生及程度，探索内皮细胞活化状态对于防治APS具有重要的临床意义[2-4]。本研究通过检测APS流产患者血小板表面活化分子CD62P、CD40L的表达水平来评估APS流产患者的血小板活化程度，进一步分析其对内皮细胞活化的作用，初步探索血小板活化介导的血小板-内皮细胞炎症反应参与APS诱发流产的机制及探讨监测APS流产患者血小板活化水平的临床意义。

1 资料与方法

1.1资料

1.1.1研究对象 以2006版国际协会Sappora分类标准[5]为入组依据。选取2016年7月至2018年10月在吉林省人民医院就诊的APS流产患者23例，年龄25～36岁，平均年龄(33.6±3.2)岁，孕6～10周，平均孕周(7.9±1.3)周；选择同期来我院就诊要求终止妊娠的正常健康早孕妇女31例，年龄20～38岁，平均年龄(32.5±4.1)岁，孕周6～12周，平均孕周(7.3±2.4)周,既往无流产、死胎、妊娠期高血压疾病等病史。两组采血前两周内均未服用抗血小板药物。研究组与对照组妇女年龄、孕周等一般资料比较差异无统计学意义(P>0.05)。见表1。

1.1.2主要试剂 血小板检测用CD41-PE、CD62P-FITC、CD40L-FITC抗体(美国BD公司)；HUVECs细胞株由吉林省人民医院中心实验室保存和复苏；IMDM培养基、胰蛋白酶为Gibco公司产品；小牛血清购于杭州四季青生物材料公司；纯化鼠抗人CD40L单抗、脂多糖(LPS)(美国Sigma产品)；TRIZOL试剂盒，逆转录反应和荧光定量PCR相关试剂(Promega产品)；ELISA检测IL-8试剂盒(Abcam产品)。

1.2方法

1.2.1血小板采集和血小板悬液制备 枸橼酸钠抗凝管采集血小板，患者空腹用14号针头经肘静脉采血4 ml，防止任何震动，避免血小板活化；二步离心法获取血小板悬液，分别于室温下800 r/min离心20 min，取上层富含血小板血浆；再次室温2 000 r/min 离心15 min，弃去上层血浆。PBS缓冲液洗涤血小板2次，IMDM培养基将血小板悬液调成为浓度4×109ml-1。

1.2.2CD62P、CD40L表达分析 流式细胞技术分别分析APS流产患者，正常早孕患者及健康体检人群CD62P、CD40L表达水平。PBS液调整血小板浓度为2×109L-1，CD41-PE和CD62P-FITC抗体各5 μl 分析CD40L水平；CD41-PE和CD40L-FITC抗体各5 μl分析CD40L水平。抗体与血小板混合后避光20 min，流式上机检测。收集10 000个血小板，以血小板标志物CD41设门分析血小板表面>CD62P及CD40L的表达百分率。

表1 患者一般资料比较

Tab.1 Comparison of general data of patients

APS recurrentabortion(n=23)Normal earlypregnancy(n=31)PAge(Year)33.6±3.232.5±4.10.29Height(cm)161.6±5.8162.5±4.70.28BMI23.3±3.823.5±4.10.86Gestational week7.9±1.37.3±2.40.24

1.2.3血小板诱导HUVECs细胞 当HUVECs细胞株达到80%以上融合状态时，弃掉原培养液，加入血小板悬液。按照以下条件分组：①未刺激组，只含有HUVECs细胞；②LPS组：LPS(20 μg/L)与HUVECs细胞共同孵育；③APS血小板组：APS患者血小板悬液与HUVECs细胞共同孵育；④特异性CD40L单抗诱导组：CD40L单抗(20 μg/L)与APS组洗涤血小板悬液室温下作用30 min后再与HUVECs细胞共同孵育；⑤对照血小板组：对照组血小板悬液与HUVECs细胞共同孵育；血小板与内皮细胞在37℃、5%CO2条件下静止孵育6 h，每组做3个复孔。

1.2.4IL-8表达 收集6孔板中共培养的细胞悬液，以3 000 r/min离心10 min，吸取上清，ELISA方法检测IL-8的表达水平。

1.2.5ICAM-1基因表达 应用SYBR Green嵌合荧光定量法检测HUVECs细胞中ICAM-1基因mRNA表达水平。反应条件：94℃预变性3 min；94℃变性 45 s、55℃退火30 s、72℃延伸45 s，循环30次；72℃终延伸10 min。同一cDNA模板均在同一反应条件下行三次重复实验，结果应用2-ΔΔCT进行统计分析。ICAM-1基因引物序列为F：′-CGAAGTGGTGAAGTTCATGG-3′，R：5′-GTACTC-GATCTCATCAGGGT-3′，GAPDH作为内参对照基因，引物序列为F：5′-GTGAGZGGTCTCTCTCTTCCT-3′，R：5′-GTGAGGGTCTCTCTCTTCCT-3′。

2 结果

2.1血小板CD62P、CD40L的水平 结果显示，早孕患者外周血血小板活化标志分子CD62P及CD40L表达水平均较正常健康人群水平升高(P<0.05)，APS流产组患者较正常健康早孕组显著升高明显(P<0.05)，APS流产组体内血小板处于更高水平的活化状态(图1，表2)。

2.2内皮细胞IL-8的表达 通过对IL-8分泌水平的比较分析，活化的血小板可以促进HUVECs细胞分泌IL-8，与正常早孕组相比，APS流产组IL-8水平显著升高(3 659±727 vs 1 623±501)pg/ml，P<0.05；应用特异性CD40L单抗可以导致HUVECs细胞分泌IL-8的水平降至(2 076±613)pg/ml，P<0.05(图2，表3)。

2.3内皮细胞ICAM-1的mRNA表达 通过对ICAM-1的mRNA相对水平的比较分析，与正常早孕组相比，APS组HUVECs细胞中ICAM-1基因表达相对水平显著升高，特异性CD40L单抗可以显著抑制HUVECs细胞中ICAM-1基因的相对表达水平(图3，表4)。

图1 流式细胞术检测血小板表面CD62P和CD40L的表达水平Fig.1 Expression level of platelet of CD62P and CD40L analyzed by Flow cytometry method

表2 血小板CD62P和CD40L的表达水平

Tab.2 Expression level of CD62P and CD40L on platelet membrane of platelets

GroupsnCD62P(%)PCD40L(%)PAPS recurrent abortion2310.27±3.7613.26±5.21Normal early pregnancy318.31±2.430.0247.34±4.460.002Healthy crowd155.14±1.870.0014.05±1.690.009

Note：Normal early pregnancy vs Healthy crowd，P<0.05； APS recurrent abortion vs Normal early pregnancy，P<0.05.

图2 HUVECs细胞分泌IL-8水平比较Fig.2 Comparison of IL-8 secretion levels in HUVECs cellsNote: 1.Control group;2.LPS group;3.APS recurrent abortion group;4.CD40L group;5.Normal early pregnancy group.*.APS recurrent abortion vs CD40L group,P<0.05；#.APS recurrent abortion vs normal early pregnancy group，P<0.05.

表3 HUVECs细胞分泌IL-8的水平

Tab.3 Level of IL-8 secreted by cultured HUVECs cells

GroupsIL-8(pg/ml)PUnstimulated group921±405LPS group4 236±812APS recurrent abortion group3 659±727CD40L group2 076±6130.045Normal early pregnancy group1 623±5010.016

Note：APS recurrent abortion vs Normal early pregnancy，P<0.05； APS recurrent abortion vs CD40L group，P<0.05.

图3 HUVECs细胞ICAM-1 mRNA相对表达水平Fig.3 Comparison of ICAM-1 mRNA relative expression levels in HUVECs cellsNote: 1.Control group;2.LPS group;3.APS recurrent abortion group;4.CD40L group;5.Normal early pregnancy group.*.APS recurrent abortion vs CD40L group,P<0.05；#.APS recurrent abortion vs normal early pregnancy group，P<0.05.

表4 HUVECs细胞ICAM-1 mRNA相对水平

Tab.4 Relative expression levels of ICAM-1 mRNA in HUVECs cells

GroupsICAM-1 mRNAPUnstimulated group1.06±0.14LPS group1.81±0.25APS recurrent abortion group1.76±0.23CD40L group1.23±0.130.026Normal early pregnancy group1.30±0.140.042

Note：APS recurrent abortion vs Normal early pregnancy，P<0.05； APS Recurrent abortion vs CD40L group，P<0.05.

3 讨论

抗磷脂综合征(APS)是临床习惯性流产发生的主要原因之一[6，7]。致病因子抗磷脂抗体可以通过激活血小板、内皮细胞、单核细胞及中性粒细胞等成分，引起机体发生促凝、组织损伤、炎症等病理过程[8，9]。在正常生理状态下，循环中的血小板处于静息状态，运行于血管内；血管损伤、血流改变或化学物质刺激等激活状态下，血小板被活，表现为血小板膜表面、膜内及血浆中特定的血小板糖蛋白成分发生改变。母体妊娠过程中，作为一种生理性保护，孕妇循环中的血小板逐步被活化，以防止分娩时过多失血。CD62P是储存于血小板α颗粒中或内皮细胞W-P小体中的一种糖蛋白，血小板或内皮细胞一旦被激活则迅速表达于细胞膜上，参与血小板活化、黏附、聚集等生理过程[10，11]。我们的临床研究证实，与正常妊娠相比，APS患者血小板活化标志物CD62P在血小板表面表达水平更高，说明在APS流产患者体内，具有更高的血小板活化状态。

CD40L是血小板活化后细胞膜表达的分子，是血小板参与疾病病理生理反应的重要介质分子，尤其是在介导血小板与内皮细胞的相互作用中发挥主要作用。研究发现，CD40L可以介导内皮细胞的损伤和凋亡，促进内皮细胞表面表达黏附分子，分泌趋化因子、活性氧、组织因子，从而促进内皮细胞参与炎症反应[12-14]。本研究发现，APS流产患者血小板表面伴随着CD62P表达增高的同时，CD40L水平也显著升高，同时利用活化的血小板体外可以显著促进培养的HUVECs细胞分泌炎症因子IL-8水平和黏附分子ICAM-1基因的表达水平；而这种对内皮细胞的诱导作用可以被特异性CD40L单抗抑制，说明血小板和内皮细胞的相互作用是由CD40L介导的，这一过程参与了抗磷脂抗体导致血栓及炎症的病理过程。

临床研究发现，通过竞争性结合血小板表面GPⅡb/Ⅲa复合物，可以有效地阻断血小板聚集，抑制抗磷脂抗体所致的血小板活化，减少APS发病中血小板聚集、血管和组织损伤，因而监控血小板活化的发生及评估其活化程度是防治APS导致流产的重要手段[15-17]。本研究通过流式细胞术检测分析APS流产患者血小板表面活化分子CD62P和CD40L的表达情况，可以有效地评估APS患者体内血小板活化状态和诱导内皮细胞炎症反应能力，为临床上监测APS的病理过程提供有效的方法。