β-氨基丙腈诱导鼠夹层动脉瘤动物模型的建立

马晓中，张韶鹏，王菁，姜楠，陈庆良*

(1. 天津医科大学研究生院，天津 300070； 2. 天津市胸科医院心外科，天津市心血管病研究所，天津，300222； 3. 天津市胸科医院病理科，天津 300222)

夹层动脉瘤(aortic dissecting aneurysm)是临床上最为凶险的疾病之一，具有发病急促，进展迅猛，死亡率高等特点[1]，目前对于其发病机制的研究多停留在疾病的终末状态。因此，探索符合人类流行病特点和病理特点的动物模型，对于研究疾病的启动和发展等的病理过程和发病机制具有重要意义。对于夹层动脉瘤动物模型的探索，已有60余年的历史，传统的外科造模方法具有手术难度大、费用高昂等不足。近年来研究者发现β-氨基丙腈(BAPN)可抑制哺乳动物体内赖氨酰氧化酶活性，从而导致大动脉壁弹力纤维和胶原纤维分离，进而发生主动脉壁扩张或夹层[2]。但不同研究之间具有较大差异[3-4]，且BAPN本身具有较大毒性[5]。本研究旨在探索BAPN诱导夹层动脉瘤动物模型的可靠性，寻求符合人类疾病特点的动物模型，为进一步研究夹层动脉瘤发病机制奠定坚实的基础。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 实验动物

SPF级4 ～ 5周龄雄性SD大鼠18只，体重(110.50 ± 2.51)g；SPF级3周龄雄性C57BL/6小鼠40只，体重(12.21 ± 0.51) g，均购自军事医学科学院卫生学环境医学研究所实验动物中心(许可证号分别为SD大鼠【SCXK (京) 2016-0006】、C57BL/6小鼠【SCXK(京)2014-0013】)。动物饲养于天津市环湖医院(天津市神经外科研究所)【SYXK(津)2018-0009】，饲养期间给予小鼠标准饲料，饲养环境房内湿度恒定，温度20 ～ 25℃。

1.1.2 试剂与仪器

β-氨基丙腈(β-aminopropionitrile，美国西格玛-奥德里奇公司)，二甲苯、无水乙醇、95%乙醇(天津市赢达稀贵化学试剂厂)，苏木色精分色液、伊红染液、苏木色精染液(北京世济合力生物科技有限公司)，10%中性福尔马林固定液(天津久圣医疗电子仪器有限公司)。

全自动脱水机(Peloris，Leica公司，德国)，生物组织包埋机(JBM-A型，久圣医疗电子仪器，天津)，切片机(RM2135，Leica公司，德国)，全自动染片机(ST5020，Leica公司，德国)，光学显微镜(BX50，Olympus公司，日本)。

1.2 方法

1.2.1 实验动物分组

所有实验动物在实验房适应3 ～ 4 d后开始实验。18只4 ～ 5周龄SD大鼠，随机分为3组，每组6只，分别记作SD-0.2(A组)、SD-0.4(B组)、SD-0.6(C组)。40只3周龄C57BL/6小鼠，随机分为4组，每组10只，分别记作C57-0.2(D组)、C57-0.4(E组)、C57-0.6(F组)、C57-对照(对照组)。

1.2.2 模型制作

A组、B组、C组大鼠分别给予0.2%、0.4%、0.6% BAPN溶液，饲养7周。D组、E组、F组和对照组小鼠分别给予0.2%、0.4%、0.6% BAPN水溶液和蒸馏水作为饮用水，饲养4 ～ 6周。所有实验动物均自由取食饮水，记录鼠每日采水量，每周进行1次体重测量，直至动脉瘤破裂死亡或实验结束。

1.2.3 实验操作

实验期间死亡的动物及时进行解剖，分离大动脉。饲养期结束后，将存活的实验动物腹腔注射过量戊巴比妥钠(200 mg/kg)处死，进行解剖。自心脏至髂动脉分叉处，充分游离大动脉，游离心脏及双肾，同时将异常的骨骼组织、肺、破裂的肠壁等脏器分离，将获取的标本于10%中性福尔马林固定液中固定24 h以上，制成4 μm石蜡切片，进行苏木素-伊红染色(HE染色)。

收集天津市胸科医院行孙氏手术的主动脉夹层患者的升主动脉标本10例，制成4 μm石蜡切片，进行苏木素-伊红染色，将夹层患者大动脉病理变化与实验动物进行分析比较。

1.3 统计学分析

2 结果

2.1 BAPN对鼠体重和采水量的影响

随着给药浓度的增加， C57BL/6小鼠和SD大鼠的药物摄入量均明显增加，采水量却呈现出减少态势，且体重增长趋势减缓，其中SD大鼠的量效关系更为明显(图1)。

2.2 生存分析

如图2所示，随着给药浓度的增加，SD大鼠和C57BL/6小鼠生存率均呈现下降的趋势。A组、B组、C组4周生存率分别为83.3%、50.0%、43.3%；7周生存率分别为33.3%、16.7%、0。C57BL/6小鼠中，D组、E组、F组4周生存率分别为70.0%、80.0%、50.0%；7周生存率分别为50.0%、40.0%、40.0%。SD大鼠和C57BL/6小鼠4周生存率、7周生存率最低组均为0.6%BAPN组。A组7周生存率最高，为50.0%，E组与F组7周生存率均为40%。

图1 C57BL/6小鼠和SD大鼠体重、采水量、BAPN摄入量情况Figure 1 Changes of body weight, water intake and BAPN intake in the SD rats and C57BL/6 mice

2.3 大动脉改变

A、B、C组给药4周后，均无动脉瘤发生；给药7周后，各组发生大动脉破裂或动脉瘤的数量分别为1只、2只、0只。 B组中共两只发生动脉瘤，1只大鼠于饲养第6周因升主动脉破裂而死，破口位于升主动脉，另1只于第7周末饲养结束时处死，解剖提示慢性夹层动脉瘤(图3)。其余大鼠，解剖后大动脉均未见明显异常。

图2 C57BL/6小鼠与SD大鼠生存曲线Figure 2 Kaplan-Meier survival curves of the SD rats and C57BL/6 mice

D、E、F组给药4周动脉瘤发生率分别为10%、20%、20%，截止第7周实验结束，各组实验动物动脉瘤发生率分别为50%、70%、60%(表1)。实验结束时，处死的实验动物中，D组1只发生升主动脉瘤；E组中，1只为升主动脉瘤，2只为降主动脉瘤；F组中2只均为升主动脉瘤。

光镜下可见实验组大动脉中膜增厚，弹力纤维排列紊乱，伴大量红细胞和淋巴细胞浸润(图4)。C57BL/6小鼠中，实验组升主动脉直径和中膜面积均呈现增长趋势(图5)。对照组升主动脉直径为(0.96 ± 0.07)mm，中膜面积为(0.19 ± 0.02)mm2；D组升主动脉直径、中膜面积分别为(0.98 ± 0.22)mm、(0.27 ± 0.12)mm2；E组升主动脉直径、中膜面积分别为(0.99 ± 0.11)mm、(0.23 ± 0.11)mm2；F组升主动脉直径、中膜面积分别为(1.02 ± 0.08)mm、(0.31 ± 0.09)mm2。

表1 夹层动脉瘤发生率(%)Table 1 Incidence rate of aortic aneurysm

注：箭头所示为破口或动脉瘤形成病理切片可见夹层形成。(100×)图3 夹层动脉瘤大体标本和病理切片改变Note. Yellow arrow indicated the location of aneurysm. Dissection formation was showed in histology. (100×)Figure 3 Macroscopic and histopathological features of the dissecting aneurysm

2.4 其他脏器改变

C57BL/6小鼠组，E组中1只小鼠发生脊柱测弯，1只小鼠死亡后解剖提示于大量胸腔积液，肺叶压缩萎陷，呈白色。其余C57BL/6小鼠解剖均未见明显脏器异常(除外大动脉破裂或扩张)。

SD大鼠组，A组中3只SD大鼠发生肠破裂，B组中有2只SD大鼠发生肠破裂，C组中4只SD大鼠发生肠破裂(表2)。发生肠破裂的大鼠，均自直肠发生肠梗阻，降结肠处发生破裂，致严重腹膜炎，空回肠严重肠胀气。解剖可见脊柱侧弯，脊柱旁或肋骨近肋脊关节出可见瘤样膨出，呈白色，质地稍硬(图6)，光镜下显示钙盐沉积，可见异形的肿瘤细胞。心肌和结肠肌层均可见不同程度的淋巴细胞浸润(图7)。

2.5 夹层动脉瘤患者大动脉病理改变

人急性主动脉夹层大动脉病理改变主要体现为：囊性中膜坏死、平滑肌细胞排列紊乱及弹力纤维断裂。其中，平滑肌细胞的形态学改变(变性坏死、排列紊乱及重塑)被认为是发生夹层动脉瘤的重要因素[6-7]。夹层动脉瘤患者平滑肌变性坏死重于平滑肌重塑、基质降解、基质黏液样变性等(图8)。

注：可见实验组大动脉中膜增厚明显，弹力纤维出现断裂、排列紊乱等改变，并有大量炎症细胞浸润，以淋巴细胞为主。(100×)图4 各组升主动脉病理改变Note. Increased thickness of the tunica media, disruption and disarrangement of elastic fibers, and inflammatory cell infiltration and many multi-nucleate giant cells are present in the aortic tissues. (100×)Figure 4 Pathological changes of the ascending aortas

注： 与对照组相比，实验组升主动脉直径和中膜面积均呈现增长趋势(P< 0.05)。图5 C57BL/6各组小鼠升主动脉直径及中膜面积变化Note. Compared with the control group, both diameter and area of tunica media showed a rising tendency (P< 0.05).Figure 5 Changes of the diameter and area of tunica media of the mouse ascending aortas

组别GroupsSD大鼠(%) SD rats (%) C57BL/6小鼠(%) C57BL/6 mice (%)肠破裂Colon rupture骨骼畸形Scoliosis胸腔积液Hydrothorax肠破裂Colon rupture骨骼畸形Scoliosis胸腔积液Hydrothorax0.2%50(3/6)0(0/6)0(0/6)0(0/10)0(0/10)0(0/10)0.4%33(2/6)33(2/6)0(0/6)0(0/10)10(1/10)10(1/10)0.6%66(4/6)33(2/6)0(0/6)0(0/10)0(0/10)0(0/10)

注.黄色箭头所示为发生脊柱侧弯、肋骨肿物、肠破裂部位。图6 骨骼、结肠大体标本Note. Yellow arrows indicated the sites of scoliosis, rib fracture and colon rupture.Figure 6 Macroscopic changes of the skeleton and colon

注： 心脏：心外膜下心肌细胞排列疏松，伴单核淋巴细胞浸润。结肠：结肠肌层分离，大量红细胞和淋巴细胞浸润。肋骨肿物：钙盐沉积，可见异形的肿瘤细胞。(100×)图7 心脏、结肠和肋骨的病理改变Note. Heart, Loose arrangement of cardiomyocytes accompanied by lymphocyte and mononuclear cell infiltration. Colon, The muscle layer was dissected, and accumulation of great amount of erythrocytes and lymphocyte infiltration. Rib, calcium deposition and heteromorphic tumor cells. (100×)Figure 7 Histological changes of the heart, colon and rib

注：A-D为急性A型主动脉夹层患者，其中D为医源性主动脉夹层。A、C、D：中膜分离，夹层形成并可见红细胞及炎性细胞浸润。B：中膜平滑肌细胞变性、坏死，弹力纤维断裂、排列紊乱，基质粘液样变性。(100×)图8 夹层动脉瘤患者升主动脉病理切片Note. A-D. Ascending aorta from a patient with acute aortic dissecting aneurysm. D. Iatrogenic aortic dissection. A, C, D. Separation of the tunica media, with erythrocyte accumulation and inflammatory cell infiltration. B. Necrosis and degeneration of smooth muscle cells, destruction and disarrangement of elastic fibers in the tunica media, and mucoid degeneration of matrix. (100×)Figure 8 Histological changes in the human aortic tissues

3 讨论

3.1 BAPN对鼠大动脉影响

赖胺酰氧化酶(lysyl oxidase, LOX)是一种具有铜结合位点的单胺氧化酶[5, 8]，相对分子质量为32 000，能够氧化胶原和弹性蛋白的赖氨酸残基，使这些纤维性蛋白的共价交联，从而形成稳定的细胞外基质。BAPN是不可逆性LOX抑制剂，能竞争性地与弹性蛋白或氨基烷基结合，从而抑制弹性蛋白和胶原蛋白的交联[2]。

BAPN处理刚离乳的幼鼠可致其大动脉中模增厚，弹力纤维、胶原蛋白等细胞外基质发生排列紊乱、坏死等病理改变，与夹层患者大动脉病理改变基本相符。3周龄幼鼠处于快速生长发育阶段，BAPN可抑制大动脉细胞外基质成分的形成，从而导致动脉瘤或动脉夹层的形成。其作用有明显的种属差异，且与发育程度密切相关[3]。Ren等[3]证实，FVB小鼠动脉瘤成模率远低于C57BL/6小鼠。本研究前期实验曾采用6周龄雄性C57BL/6小鼠，BAPN饲养6周未见大动脉异常改变。而4 ～ 5周龄SD大鼠模型成功率低、死亡率高可能与周龄过大，生长发育趋于成熟有关。

3.2 BAPN对其他脏器影响

本研究中E组(C57-0.4%)，尸检可见1只小鼠发生脊柱侧弯，1只小鼠存在大量胸腔积液，未见明显其他异常；SD大鼠组，肠破裂和肋骨肿物的发生率远高于夹层动脉瘤发生率，而类似的情况在其他动物模型研究中鲜有报道。

在哺乳动物体内，赖胺酰氧化酶家族包括5种[2, 5]，每一种酶由不同的基因编码：lysyl oxidase (LOX) 和 lysyl oxidase-like 1-4 (LOXL1 - LOXL4)。每一种LOX，其个体发育受特定组织或细胞的特异性表达和定位的调节，导致LOX的结构和功能发生的复杂变化[2, 9]。LOX功能非常广泛,除了保持细胞外基质内环境稳定外，还能够抑制Ras癌基因诱导的细胞表型的转变，以及抑制肿瘤的形成[10]，对维持细胞外基质的结构和功能的正常、组织器官的发育、创伤修复甚至肿瘤的转移都具有重要的意义[11]。BAPN可以通过修饰胶原蛋白导致心肌异常[12]；在结直肠、膀胱、食管、头颈部等组织发生的恶性肿瘤中，LOX家族相关蛋白表达明显增加，表现为促肿瘤转移作用[13]。Kubota等[14]的一项研究中，在鸡胚孵化的49天，注入BAPN，发现多发骨骼畸形，特别是胫跗骨的畸形更为明显。

基于BAPN作用机制及其他研究报道，可以认为该试剂可对全身富含弹性蛋白和胶原蛋白的结缔组织产生各种负面作用。尽管BAPN用于夹层动脉瘤动物模型有较高的成功率，由于上述种种作用，该试剂造模过程中，不可避免地会发生因其他系统严重功能障碍而导致的死亡(如SD大鼠中发生率较高的肠破裂)，模型过高的死亡率势必会影响该模型应用于下一阶段的研究。

3.3 模型成功率与BAPN量效关系

本研究中，C57-0.4组夹层动脉瘤发生率最高为70%(7/10)，采用0.4%的给药浓度，BAPN摄入量为0.6 g/(kg·d)。高艳香等[4]用同样的方式成功建立了小鼠夹层动脉瘤动物模型，其实验结果显示，夹层动脉瘤的发生对BAPN存在明显的计量依赖性，而Ren等[3]实验结果则截然相反，本实验同样不支持模型成功率与摄入量存在明显正相关系。事实上，无论将BAPN混入饲料或是饮用水中，特定给药浓度下，动物摄入饲料或水的量难以准确计量。因此，BAPN实际摄入量均存在较大误差，现有的实验方案尚需大量重复实验来验证其稳定性。

3.4 该动物模型不足之处

1)实验周期较长，大部分动物模型实验周期均以4周为限，而本实验4周成模率极低；2)本实验未采用其他特殊染色方法，无法进行弹性蛋白、胶原蛋白等定性、定量分析；3)实验进行中随着动物的死亡，存活动物的体重、采水量等计量资料不符合正态分布，未进行有效的差异性检验；4)实验动物数量相对较少，实验方案未进行重复性实验。

因种属差异性等原因，任何动物模型均不能完全代表人类疾病，研究者需根据实验需求来选择合理的动物模型。研究保护因素，可选用成模率较高的动物模型，研究危险因素则与之相反[4]。

4 结论

C57BL/6小鼠夹层动脉瘤动物模型的病理改变与夹层动脉瘤患者基本符合，选用0.4%浓度的BAPN溶液作为饮用水造模，可作为一种简便、经济、有效的动物模型进行下一步研究。然而，SD大鼠发生肠破裂、脊柱侧弯等致死性并发症比例高于夹层动脉瘤发生率，其作为夹层动脉瘤动物模型尚需进一步探索。