AAV6-hNGFβ转染对大鼠脑缺血再灌注损伤的保护作用与PI3K/Akt信号通路的关系

罗 荔 张 洁 张 丽 李晓岚

临床上缺血性脑损伤(cerebral ischemia injury)较常见，包括动脉粥样硬化引发的局灶性脑缺血、心跳骤停引发的全脑缺血等，脑卒中具有高发生率和高复发率，已成为世界第2常见死亡原因和主要致残原因[1]。神经生长因子(nerve growth factor, NGF)是一种非常重要的活性因子，近年来有研究发现，在脑缺血再灌注动物模型中，内源性NGF mRNA表达会显著增加，从而产生神经保护和修复作用，减轻脑缺血再灌注损伤[2]。在细胞的分化、增殖和凋亡等生命周期活动中，PI3K/Akt信号通路可以发挥调节作用，是一条十分重要的细胞通路[3]。PI3K/Akt信号通路中蛋白激酶B(Akt)磷酸化后处于活化状态，可以激活许多细胞保护调节机制[4]。本研究基于脑缺血再灌注大鼠模型，通过转染AAV6-hNGFβ后检测NGF、Akt、p-Akt、Bcl-2和Bax等蛋白及mRNA水平改变，探讨转染AAV6-hNGFβ减轻大鼠心肌缺血再灌注损伤作用与PI3K/Akt信号通路的关系，为脑缺血再灌注的治疗提供分子生物学依据。

材料与方法

1.实验动物及分组： 12周龄雄性SD大鼠72只，体质量250～300g，由新疆医科大学实验动物中心提供,实验动物许可证号：XJMU201700314。实验期间动物饲养于新疆医科大学动物房，每日光照约12h，自由饮食和饮水。为避免实验环境的改变对大鼠的影响，所有大鼠饲养2周后进入实验。72只SD大鼠随机方法分为4组(n=18)，即假手术(sham)组、脑缺血再灌注(I/R)模型组、hNGFβ(I/R模型组+AAV6-hNGFβ-EGFP)组和阴性对照(I/R模型组+AAV6-EGFP)组，脑缺血再灌注模型成模后，模型组大鼠经股静脉注射0.3ml 0.9%氯化钠注射液，hNGFβ组大鼠股静脉单次注射0.3ml携带hNGFβ-EGFP基因的腺相关病毒(2×1010TU/ml)，阴性对照组大鼠股静脉单次注射0.3ml携带EGFP(绿色荧光蛋白)基因的腺相关病毒(2×1010TU/ml)，各组注射1周后取材进行脑组织荧光显色。

2.材料： hNGFβ过表达腺相关病毒AAV6-hNGFβ(中国上海吉玛制药技术有限公司)，水合氯醛、多聚甲醛(中国成都科龙化工试剂厂)，Akt、p-Akt、NGF、Bcl-2和Bax抗体(美国CST公司)，TUNEL 凋亡检测试剂盒、反转录酶和荧光定量PCR试剂(中国上海生工生物工程有限公司)。

3.脑缺血再灌注模型的建立： 参照Longa法复制大鼠局灶性脑缺血再灌注动物模型[5]。大鼠用10%水合氯醛麻醉后，分离右侧颈总动脉、颈外动脉和颈内动脉，将制备好的线栓插入颈总动脉，推进约18～20mm，遇到阻力即可停止，阻断2h后，缓慢拨出线栓，扎紧动脉残端，逐层缝合组织和皮肤，缺血再灌注损伤模型制备成功。假手术组除不插线栓外，其余步骤同上。术后按照改良的神经功能缺损评分(modified neuro-logical severity scores，mNSS)进行评价，对动物进行运动实验、感觉实验(视觉、触觉和本体感觉等)、横杆平衡实验和反射检查，正常为0分，最高分为18分，分值越高神经系统损伤越严重。

4.脑梗死面积测定： 分别在1、2、4周对各组大鼠进行脑梗死面积的测定，每组6只，经水合氯醛麻醉后，迅速开胸进行心脏灌流，灌流后快速断头取脑，洗净后将脑组织在-20℃冰箱里冷冻20min，以2mm间距冠状切成5～6片，用2%的TTC磷酸盐缓冲液37℃避光染色30min，然后进行4%多聚甲醛固定24h，采用医用计算机彩色图像分析系统计算梗死体积。

5.免疫组化和TUNEL凋亡细胞检测： 用免疫组化方法检测NGF、Bcl-2、Bax和p-Akt的表达。石蜡切片常规二甲苯，乙醇脱蜡至水，水洗后分别滴加相应一抗，4℃静置过夜，HRP标记的二抗孵育30min，DAB显色后苏木精复染，常规脱水、透明、树脂封片，镜下观察，细胞核呈紫蓝色，阳性产物呈棕黄色或黄色。使用TUNEL 凋亡试剂盒进行凋亡细胞检测，按说明书中链霉抗生物素蛋白(SABC)步骤染色，石蜡切片经常规脱蜡，至水，蛋白酶K消化，TdT酶和DIG-dUTP混合液孵育2h，生物素偶联抗地高辛抗体孵育2h，SABC孵育2h，DAB显色，苏木精复染，脱水，封片，细胞核出现棕黄色颗粒为凋亡细胞。

6.Western blot法检测： 收集各实验组大鼠脑组织，匀浆处理后抽提总蛋白，BCA法测定蛋白浓度，取蛋白样品进行SDS-PAGE电泳，电转到硝酸纤维素膜，5%脱脂奶粉封闭，加入一抗后4℃孵育过夜，然后加入二抗室温孵育1h后显色曝光。采用图像分析软件Image J分析目的条带，分别计算目的条带与内参的灰度值，用两者比值表示目的蛋白的相对表达强度。

7.反转录-聚合酶链反应(RT-PCR)检测： 收集各实验组大鼠脑组织，总RNA 的提取及荧光定量PCR参照试剂说明书进行实验。

结 果

1.转染效率观察及脑缺血再灌注后神经功能评分比较： 大鼠脑缺血/再灌注术造模成功，治疗组和阴性对照组分别注射AAV6-hNGFβ-EGFP和AAV6-EGFP 1周后，荧光显微镜下观察脑组织神经元细胞中开始有绿色荧光表达，转染效率较高，其余各组则无荧光(图1)。治疗组开始注射AAV6-hNGFβ-EGFP后1、2和4周，神经功能评分同模型组及阴性对照组(模型组+AAV6-EGFP)比较，均出现明显降低(P<0.05，P<0.01)，结果见表1。

图1 大鼠脑组织神经元绿色荧光表达(×200)A.阴性对照组; B.hNGFβ组

表1 各组大鼠神经功能评分比较

与假手术组比较，*P<0.01；与模型组比较,#P<0.05；与阴性对照组比较,△P<0.01

2.各组大鼠脑梗死体积比较：图2的TTC染色结果显示脑缺血再灌注损伤4周后脑梗死情况，除假手术组外其余各组均可见白色梗死部分。与假手术组比较，模型组大鼠的脑梗死体积明显增加，差异有统计学意义(P<0.01)；与模型组及阴性对照组比较，hNGFβ组脑梗死体积明显减少，差异有统计学意义(P<0.05)。模型组与阴性对照组比较，脑梗死体积差异无统计学意义(P>0.05，图3)。

图2 各组大鼠脑组织TTC染色A.假手术组; B.模型组; C.阴性对照组; D.hNGFβ组

图3 各组大鼠脑梗死体积比较与假手术组比较，*P<0.01；与模型组比较,#P<0.05；与阴性对照组比较,△P<0.01

3.免疫组化检测NGF、p-Akt、Bcl-2和Bax表达变化： 假手术组大鼠脑组织皮质区NGF表达较多，p-Akt表达较少；造模成功后4周，与假手术组比较，模型组和阴性对照组皮质区NGF表达减少，p-Akt表达增加；hNGFβ组转染AAV6-hNGFβ-EGFP 4周后，与模型组和阴性对照组比较，大鼠脑组织皮质区NGF表达显著升高，p-Akt表达也明显增加(图3)，Akt的磷酸化水平增强。另一方面，与假手术组比较，模型组大鼠皮质区Bcl-2蛋白表达显著减少，Bax表达明显增强；hNGFβ组转染AAV6-hNGFβ-EGFP 4周后，与模型组和阴性对照组比较， Bcl-2表达显著增加，Bax表达明显减少。

图4 大鼠脑皮质区NGF、p-Akt、Bcl-2和Bax免疫组化染色(×200)A.假手术组; B.模型组; C.阴性对照组; D.hNGFβ组

4.TUNEL凋亡细胞检测： 与假手术组比较，模型组大鼠的脑组织内神经元细胞出现棕褐色颗粒，不规则形态的凋亡神经元数量明显增加；与模型组及阴性对照组比较，hNGFβ组神经元细胞核染色变浅，凋亡细胞明显减少。模型组与阴性对照组比较，凋亡神经元数量接近(图5)。

5.转染AAV6-hNGFβ-EGFP对大鼠脑缺血再灌注后Akt磷酸化水平的影响： 收集各组大鼠脑组织，采用qPCR法和Western blot法检测脑组织皮质区不同病程(1、2、4周)NGF、Akt和p-Akt的mRNA和蛋白表达水平。与假手术组比较，脑缺血再灌注损伤发生后，模型组和阴性对照组大鼠脑组织NGF的mRNA和蛋白表达明显减少，Akt的mRNA表达水平显著升高，p-Akt蛋白表达显著增强，Akt磷酸化水平(p-Akt/Akt)明显升高(P<0.01，图6)。hNGFβ组转染AAV6-hNGFβ-EGFP后，与模型组和阴性对照组比较，大鼠脑组织NGF的mRNA和蛋白表达显著增强，Akt的mRNA表达显著升高，p-Akt表达也明显增加，Akt的磷酸化水平显著提升(P<0.01)，见图6。

图5 TUNEL检测凋亡细胞(×400)A.假手术组; B.模型组; C.阴性对照组; D.hNGFβ组

6.转染AAV6-hNGFβ-EGFP对大鼠脑缺血再灌注后Bcl-2和Bax表达影响： 收集各组大鼠脑组织，采用qPCR和Western blot法检测脑组织皮质区不同病程(1、2、4周)Bcl-2和Bax的表达水平。Bcl-2和Bax的qPCR和Western blot法检测结果如图6所示，与假手术组比较，模型组Bcl-2的mRNA和蛋白表达显著减少(P<0.01)，Bax的mRNA和蛋白表达显著升高(P<0.01)，模型组和阴性对照组中，Bcl-2和Bax的mRNA及蛋白表达差异无统计学意义(P>0.05)；与模型组比较，hNGFβ组Bcl-2的mRNA和蛋白表达表达显著升高(P<0.01)，Bax的mRNA和蛋白表达显著减少(P<0.01)。

图6 大鼠脑皮质区NGF、Akt和p-Akt的mRNA和蛋白表达变化A.NGF mRNA变化; B.NGF蛋白变化; C.Akt mRNA变化; D.p-Akt蛋白变化; 与假手术组比较, *P<0.01，**P=0.000;与模型组比较,#P<0.05，##P<0.01;与阴性对照组比较，△P<0.05，△△P<0.01

图7 大鼠脑皮质区Bcl-2和Bax的mRNA和蛋白表达变化A.Bcl-2 mRNA变化; B.Bcl-2蛋白变化; C.Bax mRNA变化; D.Bax蛋白变化; 与假手术组比较, *P<0.01，**P=0.000；与模型组比较，#P<0.01;与阴性对照组比较，△P<0.01

讨 论

大脑中动脉闭塞(middle cerebral artery occlusion，MCAO)模型不需开颅，对脑损伤较小，脑病变范围与人体相近，部位恒定，梗死率高，是最常用的局灶性脑缺血动物模型[5]。模型制备完成后，可通过改良神经功能缺损评分和脑梗死体积对模型进行评价。本研究在脑缺血再灌注损伤大鼠体内注射AAV6-hNGFβ-EGFP，进行基因治疗，使合成产物 hNGFβ得到高表达，从而减轻大鼠脑缺血再灌注损伤。实验结果表明，治疗组开始注射AAV6-hNGFβ-EGFP后，神经功能评分同模型组与阴性对照组比较，均出现明显降低。此外，大鼠的脑梗死体积计算结果也表明，转染AAV6-hNGFβ-EGFP可以减少大鼠脑缺血再灌注损伤后的脑梗死体积。目前以改变细胞遗传物质为基础的基因治疗已得到广泛应用，席聪等[6]在I/R大鼠中注射rAAV-PR39-ADM过表达抗菌肽(PR39)和肾上腺髓质素(ADM)后，可改善大鼠脑缺血再灌注后局部供血，促进血管再生，保护神经元，减轻脑缺血再灌注损伤。

脑缺血再灌注损伤机制较复杂，包括细胞内钙超载、自由基生成及高能磷酸化合物缺乏等[7～9]。在脑缺血再灌注程中，能保护神经细胞的因子减少，损害神经细胞的因子增多(如氧自由基、炎性和凋亡因子等)，从而严重影响脑缺血性脑卒中患者的愈后，而保护神经元细胞并减少其凋亡，可以防止脑卒中引起的神经功能障碍[10～12]。作为神经营养因子家族(NTFs)中一种非常重要的活性因子，NGF在脑内主要来源于神经元和胶质细胞。脑缺血性损伤发生后，NGF不仅可以保护和减少神经元损伤，还可以促进神经元的修复，提高神经元存活率。脑缺血损伤发生早期，NGF会出现短时反应性表达，发挥神经元保护作用，但表达水平和时间有限，难以发挥全面持久的神经元保护作用。

对于脑缺血后神经损伤的保护而言，能持续增强NGF表达的治疗方法，具有十分重要的意义。在细胞的分化、增殖和凋亡等生命周期活动中，PI3K/Akt信号通路可以发挥调节作用，该通路由许多靶点组成，其中蛋白激酶B(Akt)是最关键的一个，因为Akt磷酸化后处于活化状态，通过激活可作用于下游的B细胞淋巴瘤/白血病2(Bcl-2)家族等靶点，可降低下游Bax蛋白的表达，抑制凋亡，从而起到神经保护作用[13]。本研究结果表明，与假手术组比较，NGF表达显著下降，PI3K/Akt通路受到抑制，Bcl-2蛋白表达显著降低，Bax蛋白表达明显增加，差异有统计学意义(P<0.05)；与模型组和阴性对照组比较，hNGFβ组NGF表达显著升高，PI3K/Akt通路得到激活，Bcl-2蛋白表达也显著升高，Bax蛋白表达明显降低，差异有统计学意义(P<0.05)。转染AAV6-hNGFβ-EGFP可提高NGF表达，激活大鼠PI3K/Akt通路，提高Bcl-2蛋白表达，抑制Bax蛋白增加，对大鼠脑缺血再灌注损伤起到保护作用。

在脑缺血再灌注动物模型中，提高NGF的表达，可激活PI3K/Akt通路的多个靶点，调控下游相关蛋白表达，发挥对脑缺血再灌注损伤的保护作用。Saito等[14]研究发现脑缺血损伤后，由于PI3K与NGF受到抑制，磷酸化PRAS(pPRAS)的表达出现下调，而加入NGF可以提高小鼠中pPRAS的表达，从而增强神经保护作用。远端缺血后处理可以通过上调内皮型一氧化氮合酶(eNOS)，激活PI3K/Akt途径而产生神经保护作用，减轻全脑缺血再灌注损伤[15]。此外，NGF还可通过激活PI3K/Akt途径，减少内质网应激导致的心肌细胞凋亡，对心肌缺血再灌注损伤进行保护[16]。另一方面，NGF还可通过多种途径保护神经元损伤，如抵消兴奋性氨基酸毒性、调节神经元胞质内Ca2+水平和促进自由基的清除等。Rami等[17]研究发现，β2肾上腺素受体激动剂克伦特罗具有神经保护作用，其保护机制与上调NGF表达有关，NGF上调可增强钙蛋白酶抑制蛋白的表达而产生神经保护效应。

Zhang等[18]研究发现，在脑卒中早期阻断TRPV2表达后，可以通过MAPK/JNK途径诱导NGF分泌，促进星形胶质细胞的增殖而产生神经保护作用。NGF的神经元保护作用还与转录因子AP-1的激活有关，Shashoua等[19]设计了一种NGF的模拟短肽，可以通过激活转录因子AP-1来进行脑卒中的治疗。

综上所述，本研究基于脑缺血再灌注大鼠模型，通过神经行为学、梗死体积、免疫组化和分子生物学等方法，发现转染AAV6-hNGFβ可增强大鼠脑组织NGF表达，进而激活PI3K/Akt通路，提高Bcl-2蛋白表达，降低Bax蛋白合成，抑制凋亡，对大鼠脑缺血再灌注损伤起到保护作用，为脑卒中的临床治疗提供依据。