长链非编码RNA NEAT1对非小细胞肺癌增殖和凋亡的影响及其机制①

李宝辉 马 辉 侯明明 李新萌 陈 虎 孔祥军

(沧州市中心医院中心实验室，沧州 061001)

肺癌是世界上癌症相关死亡的最常见原因之一，非小细胞肺癌(Non-small cell lung cancer，NSCLC)作为肺癌的主要亚型占所有病例的70%～80%[1]。虽然肺癌的诊断和治疗取得了很大进展，但总体生存率仍然不高，高死亡率可能与早期肿瘤转移和复发有关[2]。因此，迫切需要更好地了解NSCLC进展中涉及的分子机制，并为患者找到更有效的治疗方法。近年来研究发现，许多长链非编码RNA(long non-coding RNAs，lncRNAs)在生物过程中发挥重要作用，包括细胞增殖，转移和分化[3-5]。许多失调的lncRNA参与NSCLC的各种生物学活性，例如，lncRNA PTV1、MALAT-1和HOTAIR[6-8]。然而，很少有研究关注富含核的丰富转录物1(Nuclear enriched abundant transcript 1，NEAT1)在NSCLC中的作用。本研究探讨了NEAT1在NSCLC中的潜在功能，并初步分析了其相关机制，Wnt/β-catenin信号通路在调节肿瘤发展的多个方面(包括NSCLC)中起重要作用，NEAT1是一种新型的lncRNA，在许多癌症中起着重要的调节作用，因此我们进一步探讨了NEAT1是否可能参与Wnt/β-catenin信号通路。

1 材料与方法

1.1材料

1.1.1试剂及仪器 非小细胞肺癌细胞系A549、SPCA1和正常细胞系BESA-2B均购自中国科学院生物化学与细胞生物学研究所，Transwell、SOX9及GAPDH一抗购自美国BD公司，RPMI1640培养基购自美国Gibco公司，Trizol和细胞转染试剂购自美国Invitrogen公司，一步法RT-PCR试剂盒购自大连宝生物工程有限公司，荧光检测试剂盒购自美国Promega公司。实验所用PCR仪为ABI 7500，酶标仪为Thermo FC。

1.1.2组织标本 收集自2015年1月至2016年12月来我院就诊经病理学诊断确诊为NSCLC的患者91例，手术前未进行局部或全身治疗，获取其NSCLC组织和相邻非肿瘤组织，液氮中快速冷冻后于-80℃超低温冰箱中保存。本研究已获得沧州市中心医院伦理委员会批准(2017-139-01)。

1.2方法

1.2.1细胞培养、转染及分组 NSCLC细胞系A549、SPCA1及正常人肺细胞系BESA-2B均用含10%胎牛血清、100 U/ml青霉素和100 mg/ml链霉素的RPMI1640培养基于37℃、5%CO2培养，48 h消化传代。分5组进行细胞转染：si-NEAT1组、si-NC组(阴性对照组)、miR-101-3p模拟物组、miR-101-3p抑制剂组和si-SOX9组，扩增引物见表1，采用2-ΔΔCt法进行相对定量。

1.2.2MTT实验 应用改良MTT实验评估细胞活力，连续观测96孔板(5 000细胞/孔)24 h。细胞转染48 h后，加入20 μl MTT(5 mg/ml)，继续培养4 h，弃上清后加入总共200 μl二甲基亚砜(DMSO)，测量490 nm吸光度。

表1 NEAT1、miR-101-3p扩增引物Tab.1 Amplification primer of NEAT1 and miR-101-3p

1.2.3Transwell实验 通过Transwell实验检测细胞迁移和浸润，应用Transwell小室检测细胞迁移，细胞浸润Transwell小室以30 mg/cm2基底膜(BD)包被后于37℃孵育1 h形成基质屏障。DMEM稀释细胞至1×105细胞/孔，5%CO237℃孵育24 h后，甲醛固定10 min，结晶紫染色10 min，PBS洗涤后，显微镜下随机选取10个视野(200×)计算膜下细胞数，重复3次，侵袭细胞数越多表示侵袭能力越强。

1.2.4Western blot实验 通过免疫印迹实验检测NSCLC细胞中SOX9、β-catenin和c-Myc的表达情况。培养或转染的细胞以RIPA缓冲液裂解，BCA法提取蛋白质定量，10%SDS-PAGE电泳，转膜后于5%脱脂牛奶(含0.1%吐温的PBS)孵育1 h，加入anti-SOX9、anti-β-catenin、anti-c-Myc和anti-GAPDH一抗4℃过夜，加入辣根过氧化物酶标记的二抗(1∶5 000，Abcam)孵育，EMD显影，GAPDH为蛋白标准。

2 结果

2.1NEAT1在NSCLC组织和细胞中高表达 通过qRT-PCR检测NSCLC组织、癌旁正常组织以及肺癌细胞系A549和SPCA1中NEAT1 mRNA的表达，从表2中可见NSCLC组织中NEAT1 mRNA表达量明显高于正常组织(P<0.05)，NSCLC细胞系A549和SPCA1中NEAT1 mRNA表达量也显著高于人类正常肺细胞系BESA-2B(P<0.05)。另外，NEAT1的表达量与NSCLC患者的TNM分期及淋巴转移显著相关(P=0.000)。

表2 NEAT1在NSCLC中的表达及与病理分期的关系(n=91)Tab.2 Relationship of expression of NSCLC with patho-logical stage(n=91)

2.2NEAT1沉默后抑制NSCLC细胞的增殖、迁移和浸润 对si-NEAT1转染细胞进行qRT-PCR检测，NEAT1的表达量显著下调(P<0.01，图1A)，MTT实验也显示A549和SPCA1转染细胞与对照组相比NEAT1的表达受到抑制，NEAT1沉默组细胞的迁移和浸润数量明显减少，表明NEAT1沉默抑制了NSCLC细胞的代谢活性(图1B)。

图1 NEAT1沉默对NSCLC细胞代谢活性的影响Fig.1 Effect of NEAT1 silencing on metabolic activity of NSCLC cellsNote:A.The expression of NEAT1 after si-NEAT1 transfection；B.The metabolic activity of NSCLC cells after NEAT1 silenced.

2.3miR-101-3p的表达 通过检测si-NEAT1转染细胞A549和SPCA1中miR-101-3p的表达量发现，si-NEAT1转染后miR-101-3p的表达显著增高(P<0.05)，然而miR-101-3p的表达上调并不影响NEAT1的表达(P>0.05)，因此推断miR-101-3p可能是NEAT1的抑制剂靶点(图2)。

图2 NEAT1与miR-101-3p的相关性Fig.2 Correlation of NEAT1 and miR-101-3pNote:A.The expression of miR-101-3p after si-NEAT1 transfection；B.The expression of NEAT1 after miR-101-3p overexpression.

2.4SOX9/Wnt/β-catenin信号通路与NSCLC的关系 应用Western斑点实验检测si-SOX9转染A 549和SPCA1细胞系中的蛋白表达情况，结果如图3所示，β-catenin和c-Myc的表达显著降低，同时在miR-101-3p过量表达的细胞中SOX9、β-catenin和c-Myc的表达显著降低，而在miR-101-3p受到抑制后其表达明显升高，表明NEAT1/miR-101-3p/SOX9/Wnt/β-catenin信号通路在NSCLC发生发展中具有重要作用。

图3 si-SOX9转染及miR-101-3p过量表达前后β-catenin和c-Myc的表达情况Fig.3 Expression of β-catenin and c-Myc in NSCLC cells before and after si-SOX9 transfection and miR-101-3p overexpression

3 讨论

近年来对于lncRNA的研究越来越多，大量证据表明其与癌症的侵袭和转移有关。Mang等[9]报道lncRNA NEAT1通过调节hnRNP A2的表达而促进肝癌的发生发展，且该调控与NEAT1-U2AF65蛋白复合物有关，可为肝癌的治疗提供潜在靶点。Sun等[6]研究发现lncRNA NEAT1可作为has-miR-377-3p的竞争内源性RNA抑制其与E2F3的结合，是促进NSCLC进展的核心致癌基因，认为NEAT1作为内源性RNA调节E2F3的表达，建立起了调节性miRNA网络与NSCLC发生发展的联系。然而lncRNA NEAT1在NSCLC中的具体作用机制尚不清楚。

NEAT1在多种肿瘤中已有研究，邢宏松等[10]研究发现lncRNA NEAT1在肝癌细胞系中高表达，沉默lncRNA NEAT1表达可抑制肝癌细胞增殖、迁移和侵袭，其机制可能与调控miR-211/SATB2信号途径有关。帅勇锋等[11]研究发现lncRNA NEAT1在胃癌细胞株中高表达，lncRNA NEAT1沉默表达抑制胃癌增殖并诱导凋亡，可能与p-Akt、bcl-2下调bax上调有关。徐笑宇等[12]检测宫颈病变患者血清中lncRNA NEAT1的表达水平发现，宫颈癌患者NEAT1表达水平低于健康对照组。潘翔等[13]检测肾癌组织及其癌旁组织中NEAT1的表达量发现NEAT1在肾癌组织中表达明显下调，并与癌组织类型、肾癌TNM分期和AJCC分期无明显相关性。上述研究表明NEAT1在不同癌症中分别发挥着促进和抑制的作用。

本研究发现NEAT1在NSCLC中发挥促进作用，其在NSCLC组织和细胞中均较正常对照呈高表达，且NEAT1的表达与NSCLC的临床分期密切相关，NEAT1沉默能够抑制NSCLC细胞的增殖、迁移和浸润。既往研究表明lncRNA能够调控miRNA的表达和活性，Lo等[14]发现BRCA1/NEAT1/miR-129-5p/WNT4信号通路在乳腺癌中发挥致癌作用。Wang等[15]发现lncRNA NEAT1通过调节miR-107/CDK6途径促进喉鳞状细胞癌的发生发展，认为NEAT1可作为其治疗的潜在靶点。然而lncRNA和miRNA在NSCLC中的研究文献还很少，尚需大量的研究予以证实。本研究中，我们通过证实了miR-101-3p为NEAT1的抑制靶标，下调NEAT1的表达能够增加miR-101-3p的表达，但是miR-101-3p表达增高并不能影响NEAT1的表达，因此认为miR-101-3p是NEAT1的直接靶标。

Wnt/β-catenin信号通路能够通过调节多功能β-catenin蛋白活性而在多种细胞间发挥重要作用，近来研究发现在肿瘤进展中Wnt/β-catenin信号通路与SOX9间具有显著的相关性，比如Santos等[16]发现SOX9升高后作用于Wnt信号传导驱动胃癌进展，Ma等[17]发现SOX9驱动前列腺癌中的Wnt信号通路，Prévostel等[18]发现SOX9是一种控制Wnt/β-catenin的非典型肠癌抑制因子。本研究发现SOX9可以作为miR-101-3p的靶标，NEAT1通过激活NEAT1/miR-101-3p/SOX9/Wnt/β-catenin轴在NSCLC进展中发挥致癌作用，因此认为NEAT1有望成为NSCLC基因治疗的新靶标。