NLRP3、PYCARD、CASP1在痛风性关节炎患者中的变化特点及其临床意义①

张志明 齐张旸 徐丛荣 黄青青 赵钟文 吴宽裕 陈煜宇 王亮萍 吴方真

(福建中医药大学附属第二人民医院风湿免疫科，福州 350003)

痛风是一种尿酸盐结晶沉积在关节滑膜、滑囊、软骨及其他组织引起的晶体相关性疾病，以反复发作的痛风性急性关节炎、皮下痛风石、痛风性肾病、尿路结石为主要临床表现，严重时可致关节畸形和功能障碍。本病好发于40～50岁中年男性，是最常见的炎症性关节炎，我国的患病率约为 1.1%。患者多在夜间发病，病损部位可出现红、肿、热和压痛感，还会伴随全身无力、发热、头痛等症状[1]。核苷酸结合寡聚化结构域样受体3(NLRP3)、半胱天冬酶-1(CASP1)、凋亡相关斑点样蛋白(PYCARD)均与炎症反应存在一定关联[2]。研究选取我院确诊的90例GA患者(GA组)及健康体检志愿者(对照组)，采用RT-PCR技术检测两组NLRP3、PYCARD、CASP1 mRNA表达水平，分析各指标与GA患者血清炎症因子之间的关系，现报告如下。

1 资料与方法

1.1资料

1.1.1临床资料 选取我院2016年2月至2017年4月确诊的90例GA患者(GA组)、选取健康体检志愿者90例(对照组)。GA组，年龄36～78岁，平均(57.5±13.0)岁，男79例、女11例，体重指数(BMI)(22.6±2.4)kg/m2，其中急性GA患者60例(AGA组)、非急性期GA患者30例(NAGA组)。对照组，年龄33～79岁，平均(58.0±15.2)岁，男75例、女15例，体重指数(BMI)(22.4±2.8)kg/m2。两组研究对象的年龄、性别、BMI比较，差异不具有统计学意义(t=-0.237、P=0.813，χ2=0.719、P=0.396，t=0.514、P=0.608)。

1.1.2纳入标准 ①GA患者的诊断标准参考2015年美国风湿病协会(ACR)/欧洲抗风湿病联盟制定的诊断标准[3]；②患者年龄范围19～79岁；③对照组为体检健康志愿者；④本研究获得患者本人的知情同意，经我院医学伦理委员会的批准。

1.1.3排除标准 ①恶性肿瘤；②血液系统疾病；③伴有严重的精神疾病、认知功能障碍；④免疫功能缺陷；⑤脑血管疾病；⑥甲状腺功能疾病；⑦心肌梗死、心衰、心瓣膜疾病等；⑧严重的肝肾功能疾病。

1.1.4口服药物 秋水仙碱片(生产企业：西双版纳版纳药业有限责任公司，批准文号：国药准字H53021369)。

1.2方法

1.2.1RT-PCR技术 两组患者均取外周静脉血3 ml，立即置入含有肝素钠的抗凝管中。将外周血单个核细胞无菌分离，用Trizol试剂(生产厂家：Invitrogen 公司)，严格按说明书操作提取总RNA，加入30 μl无RNA酶水溶解RNA，在取5 μl RNA样品进行琼脂糖凝胶电泳，在琼脂糖凝胶图谱中显示28S、18S、5S 三条带，计算 A260/A280，只采用比值范围在1.8～2.0者。cDNA的合成则严格按照逆转录试剂说明书操作，所选参数为37℃ 15 min，85℃ 5 s 终止反应。将产物cDNA在-20℃条件下保存，作备用。

以对照组和GA组的cDNA建立25 μl的反应体系，对此进行PCR扩增，将扩增所得产物用 1%琼脂糖凝胶电泳检测，琼脂糖凝胶中加入Green-View核酸染料，后将琼脂糖凝胶用FUSION-Fx5曝光机进行曝光拍摄，曝光机由北京五洲东方科技发展有限公司生产。对曝光所得的PCR目的条带图进行灰度值测定，NLRP3、PYCARD、CASP1 mRNA表达量由NLRP3、PYCARD、CASP1灰度值比内参灰度值表示。

1.2.2血清炎症因子检测 检测AGA组、NAGA组患者的血清IL-6、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)。

患者抽取静脉血3 ml，将得到的血液立即放入含促凝剂的试管中，静置30 min，离心3 min，取适量血清对IL-6、TNF-α进行测定，两种指标均采用ELISA方法进行测定，IL-6 ELISA试剂盒来自上海百蕊生物科技有限公司，TNF-α ELISA试剂盒则来自上海基免实业有限公司，上述操作样按照试剂盒说明书进行。

1.2.3治疗方法 依据2016年中国痛风诊疗指南治疗患者[4]，在低嘌呤饮食、足量饮水前提下，急性发作期在症状出现 12 h内服用秋水仙碱片(剂量1 mg，1 h后服用0.5 mg)和 (或)非甾体类抗炎药 (NSAIDs)( 如果需要加用质子泵抑制剂)，口服糖皮质激素 ( 泼尼松 30～35 mg/d 使用 3～5 d) 或抽取关节液并注射糖皮质激素，具体治疗方案根据患者病情个性化调整。非急性期根据患者病情，继续逐渐降低血尿酸水平，减少血尿酸突然大幅度波动，防止痛风石形成，终生维持患者血尿酸水平<360 μmol/L，对于严重痛风患者血尿酸水平<300 μmol/L。采用小剂量别嘌呤醇开始，以100 mg/d开始，每2～4周加量100 mg，以达到目标水平，且注意治疗过程中尿酸监测，配合预防治疗，嘱避免高嘌呤饮食。

2 结果

2.1治疗前GA组和对照组的NLRP3、PYCARD、CASP1 mRNA表达水平比较 GA组患者治疗前的NLRP3 mRNA表达水平低于对照组(P<0.05)，GA组患者的PYCARD、CASP1 mRNA表达水平高于对照组(P<0.05)，见表1。

表1 GA组和对照组的NLRP3、PYCARD、CASP1 mRNA表达水平比较

2.2治疗前不同病情GA患者NLRP3、PYCARD、CASP1 mRNA表达水平比较 治疗前不同GA组患者比较，AGA组患者的NLRP3、CASP1 mRNA表达水平高于NAGA组(P<0.05)，而PYCARD mRNA差异不具有统计学意义(P>0.05)，见表2。

表2 不同病情GA患者NLRP3、PYCARD、CASP1 mRNA表达水平比较

2.3治疗前后的GA患者NLRP3、PYCARD、CASP1 mRNA表达水平比较 GA组患者的治疗后的NLRP3 mRNA水平显著升高且差异具有统计学意义(P<0.05)，CASP1 mRNA、PYCARD mRNA表达水平在治疗后显著降低且差异具有统计学意义(P<0.05)，见表3。

表3 治疗前后的GA患者NLRP3、PYCARD、CASP1 mRNA表达水平比较

2.4治疗前不同病情GA患者炎症 指标水平比较 AGA组患者的IL-6表达水平低于NAGA组(P<0.05)，而TNF-α差异不具有统计学意义(P>0.05)，见表4。

表4 不同病情GA患者炎症指标水平比较

2.5GA患者治疗前炎症指标与NLRP3、PYCARD、CASP1 mRNA表达水平相关性 治疗前，GA组患者的NLRP3 mRNA 与IL-6、TNF-α呈负相关，且具有统计学意义(P<0.001)；PYCARD、CASP1 mRNA与GA患者的IL-6、TNF-α呈正相关，且具有统计学意义(P<0.001)，见表5。

表5 相关性分析结果Tab.5 Correlation analysis results

3 讨论

痛风性关节炎的病因主要是体内尿酸过多，在痛风性关节炎患者体内长期存在嘌呤代谢障碍，该过程导致嘌呤的最终代谢产物尿酸增高，血中尿酸浓度高于正常值，医学上称为“高尿酸血症”[1]。当血中尿酸浓度超过饱和溶解度时就会析出成为结晶体，在软组织或关节中积存，使身体出现炎症反应。痛风性关节炎也与饮食、天气变化及外伤等多方面的因素密切相关[4]。痛风性关节炎患者可能会出现痛风石、整个关节呈暗红色、高尿酸血症、非对称性关节肿痛等现象[5,6]。常用治疗方式主要为药物治疗，急性期患者可选用非甾体抗炎药、秋水仙碱、糖皮质激素进行治疗，缓解期主要以抑制尿酸生成和促进尿酸排泄为目的使用药物，无症状高尿酸血症的治疗主要包括减肥、控制血脂、减少非必要的利尿剂应用、控制饮食等[4]。

NLRP3的基因多态性与痛风性关节炎的关节状态、遗传易感性及药物治疗效果均有密切关系，主要起到调控CASP1 的作用，NLRP3 与CASP1 可形成NLRP3炎症体，发挥调控机体炎症反应的作用[7-9]。CASP1 主要通过多条信号通路参与细胞炎症及凋亡，调节细胞存活与死亡的平衡[10]。PYCARD是炎症复合体中重要的接头分子蛋白，主要是通过自身的寡聚化来集中上游受体蛋白和下游炎症相关蛋白，进而形成一个炎症复合体[11]。PYCARD与炎症相关的CASP1 所组合成的复合物，在天然免疫中发挥着重要的作用，此外PYCARD还参与了NLRP3炎症复合体的形成[12]。目前，NLRP3 mRNA水平在治疗前后的变化尚有争议，有文献报道治疗后NLRP3 mRNA水平显著降低，亦有学者报道治疗后NLRP3 mRNA水平较治疗前显著升高[7,13]。我们的研究证实，GA组患者治疗后NLRP3 mRNA水平显著升高且差异具有统计学意义，与部分学者报道的结果一致[5,7]。目前关于造成上述结果的原因尚不清楚，可能与患者的具体诊疗方案有关，亦可能与NLRP3基因多态性存在一定联系，但其机制仍有待进一步探讨。另外，本研究证明，CASP1、PYCARD mRNA表达水平在治疗后显著降低且差异具有统计学意义，说明经过治疗后GA组患者痛风改善与体内的炎症反应下降存在一定关系，但炎症反应与痛风改善之间的因果关系仍有待进一步研究。

GA组患者的NLRP3 mRNA表达水平低于对照组，而PYCARD、CASP1 mRNA表达水平高于对照组，该结果提示NLRP3基因表达在炎症反应中呈现负性调节效果，而PYCARD、CASP1可能在GA发病起中发挥促进作用。 AGA组患者的NLRP3、CASP1 mRNA表达水平高于NAGA组，而PYCARD mRNA差异不具有统计学意义，提示通过检测NLRP3、PYCARD、CASP1的表达可能有助于判断GA的分类，选择最佳治疗药物与用药疗程。

单核巨噬系统在急性痛风性关节炎(AGA)发生发展中具有重要意义，此阶段涉及IL-6、TNF-α等多种炎症因子，在发病过程中患者体内的IL-6水平上升，进入机体循环中，机体呈现全身急性时相反应，进而出现发热、身体不适等现象[14]。TNF-α具有主导炎症因子的作用，对炎症因子具有促进效果[15]。AGA组患者的IL-6、TNF-α表达水平高于NAGA组，该结果说明IL-6、TNF-α在AGA发病密切相关。GA组患者的NLRP3 mRNA 与IL-6、TNF-α呈显著的负相关关系，PYCARD、CASP1 mRNA与GA患者的IL-6、TNF-α呈显著的正相关关系，即各指标之间均存在密切联系，在临床中可通过结合各项指标对GA的病情进行判断，也提示我们PYCARD、CASP1的表达在GA各种炎症因子的释放和成熟过程中的重要性。

综上所述，NLRP3、PYCARD、CASP1 mRNA表达水平变化与GA患者病情变化及炎症反应程度之间存在密切关联。通过检测NLRP3、PYCARD、CASP1 mRNA表达有助于评估患者病情，指导后续治疗。通过调节NLRP3、PYCARD、CASP1 mRNA表达水平可能是GA治疗的新靶点。