结核性脑膜炎实验室诊断现状与展望

李自慧 张宗德

WHO[1]估计，2018年全球新发结核病患者1000万例左右，约150万例死于结核病。结核性脑膜炎(tuberculous meningitis, TBM)是最常见的中枢神经系统结核病，约占所有结核病的1%，占肺外结核的5%～10%[2-6]。TBM的致死率高达10.0%～36.5%，生存的患者常残留神经系统后遗症，而在 HIV感染者和儿童患者中后果往往更为严重[4, 7]。

早期诊断和及时治疗对于改善TBM患者预后至关重要，但TBM患者的临床表现和影像学变化均不典型，现有的实验室诊断方法敏感度较低，致使TBM的诊断异常困难。有研究者根据临床特征制订了诊断评分系统用以改善TBM的临床诊断，该系统诊断TBM的敏感度和特异度分别为86%～98%和68%～88%，但其在HIV感染的隐球菌性脑膜炎患者中常出现假阳性而导致特异度较低[4]。因此，面对TBM诊断这一全球性难题，目前仍需进一步加强实验室诊断研究，研发更为有效的TBM实验室诊断方法。

TBM实验室诊断现状

目前，有关TBM的实验室检测方法众多，主要分为细菌学检测、病原分子检测和基于宿主反应的检测三大类。尽管其中尚没有一种方法能达到简单、快捷、经济、可靠的效果，但上述三大类检测技术对于目前TBM的诊断仍具有重要意义。

一、细菌学检测

脑脊液中检测到结核分枝杆菌是TBM确诊的金标准。脑脊液离心沉渣涂片结合萋-尼染色或荧光染色镜检最为简单快速，但脑脊液中结核分枝杆菌数量很低，通常小于100个/ml，而镜检低限为100个/ml[7]，因此涂片镜检阳性率非常低，通常低于20%，甚至为0%[8-12]。脑脊液分枝杆菌培养的方法敏感度有所提高，并能进一步获取药物敏感性试验(简称“药敏试验”)结果，但基于BACTEC MGIT 960全自动分枝杆菌培养及药敏试验的液体培养约需10 d，固体培养约需8周，TBM患者病情复杂凶险，通常无法等到培养结果再采取治疗措施。2011年WHO推荐显微镜观察药物敏感性(microscopic observation drug susceptibility, MODS)液体培养法，其采用倒置显微镜观察微量滴定板里细菌的生长，平均检测时间为1周左右，对TBM诊断的敏感度达64.9%，但该方法在检测标准化和自动化方面还需改进[13]。噬菌体生物扩增法诊断TBM的敏感度略高于离心涂片和液体培养法[14]，但总体上敏感度中等且不同研究结果差异大，所需测定条件严格，因此还需进一步改进[15]。另外，增加脑脊液检测样本量、延长镜检时间、改良抗酸染色等可在一定程度上提高TBM的阳性检出率[10, 16-17]，但在临床工作中往往较难实现。

二、病原分子检测

近年来结核分枝杆菌核酸扩增试验(nucleic acid amplification tests, NAAT)检测技术发展迅速，其常以IS6110、rpoB等为靶标，通过聚合酶链式反应(polymerase chain reaction, PCR)、巢式PCR、多重PCR或实时荧光定量PCR进行扩增和检测。商业化试剂盒主要有Xpert MTB/RIF(简称“Xpert”)、环介导等温扩增技术(loop-mediated isothermal amplification, LAMP)、线性探针检测等。Meta分析表明，脑脊液Xpert对TBM确诊患者的诊断准确率较高，敏感度和特异度分别为57%(38%～74%)和98%(89%～100%)，对临床疑似患者检测的敏感度和特异度分别为13%(6%～28%)和98%(92%～100%)[18]；Xpert与传统培养法敏感度接近，但在自动化、检测时间及获取耐药结果方面优势明显[12, 19]。脑脊液行LAMP检测对TBM临床诊断患者的敏感度为43%～88%，特异度为80%～100%，其优点是操作简单、快速，适用于基层单位开展[20-22]。线性探针方法(如MTBDRplus和MTBDRsl试剂盒)不仅可检测脑脊液中的结核分枝杆菌，还能同时检测菌株对多种抗结核药物的耐药情况[23-24]。因此，尽管目前核酸检测仍然费用昂贵、存在假阳性风险，但对于提高TBM检出率、缩短获取病原学证据和药敏试验结果时间方面具有重要意义。

在结核分枝杆菌抗原检测方面，以脂阿拉伯甘露聚糖(lipoarabinomannan, LAM)检测最为常用。有报道LAM商业化试剂盒在检测HIV感染、CD4+T淋巴细胞计数低(<50个/μl)的结核病患者尿液样本时，敏感度达66.7%，特异度高于98%[25]，但其用于检测脑脊液样本的研究不多并且结果差异较大。例如Patel等[26]和Siddiqi等[27]报告，脑脊液LAM检测TBM患者(HIV感染者分别占84%和86%)的敏感度分别为31%和22%，特异度均为94%。Cox等[28]采用尸检时从第四脑室获取的脑脊液样本进行LAM检测，检测TBM的敏感度和特异度分别为50%和70%；而Bahr等[29]采用类似方法检测临床脑脊液样本时，却无一例检出。因此，LAM检测对TBM的诊断价值还需做进一步评估。

三、基于宿主反应的检测

目前，仍缺乏可靠的基于宿主体液免疫反应的结核分枝杆菌抗体检测方法，而基于宿主细胞免疫反应判断结核分枝杆菌感染的方法主要包括结核菌素皮肤试验(tuberculin skin test, TST)和γ干扰素释放试验(interferon-gamma release assay, IGRA)两种。TST价格低廉、操作简单，适于人群筛查，缺点是结果易受卡介苗接种的影响而出现假阳性。IGRA通过检测结核分枝杆菌特异性抗原刺激活化效应T细胞产生的γ干扰素来判断是否存在结核分枝杆菌感染，敏感度和特异度较强；其产品主要基于酶联免疫斑点试验[如结核感染T淋巴细胞斑点试验(T-SPOT.TB)]和酶联免疫吸附试验[如QuantiFERON-TB Gold (QFT-G)]。目前认为，IGRA不能有效区分活动性结核病和潜伏性结核感染，不能用于确诊或排除结核病，对于菌阴结核病有辅助诊断价值，检测非血液标本的诊断价值需做进一步评估[30]。中国[31-33]、韩国[34]、南非[35]的几项研究显示，脑脊液和外周血T-SPOT.TB诊断TBM的敏感度分别为58%～92%和70%～91%，特异度分别为79%～97%和58%～87%。也有研究认为脑脊液QFT-G对TBM无诊断价值，全血QFT-G诊断TBM的敏感度(44.4%)和特异度(62.5%)也较低[36]。另外，脑脊液IGRA检测也存在脑脊液需要量大(4 ml以上)、不确定结果的比例高等缺点。因此，采用IGRA检测TBM的效果并不理想。

脑脊液腺苷脱氨酶(adenosine deaminase, ADA)水平对于TBM诊断也有一定参考意义。Tuon等[37]通过分析13项研究发现，脑脊液ADA在1～4 U/L时，敏感度>93%，特异度<80%，有助于排除TBM；>8 U/L时，敏感度<59%，特异度>96%，有助于TBM诊断；但ADA无法区分TBM与细菌性脑膜炎。另一篇纳入20项研究的综述表明，脑脊液ADA诊断TBM的敏感度和特异度分别为89%(84%～92%)和91%(87%～93%)[38]。因此，在排除细菌性脑膜炎的情况下，简单快捷的脑脊液ADA检测对于条件有限地区的TBM诊断有重要参考意义。

TBM实验室诊断最新研究进展

提升TBM实验室诊断能力有赖于改进现有方法和开发新的标志物及方法，同时需要加快对新方法的诊断价值评估。近年来相关研究进展主要集中在结核分枝杆菌分子检测和宿主标志物筛选鉴定两方面。

一、结核分枝杆菌分子检测及诊断价值评估

(一)结核分枝杆菌核酸扩增检测

新一代Xpert——Xpert Ultra的主要目标是进一步提高检测的敏感度(尤其是含菌量很少的结核病)和检测利福平耐药的可靠性[39]，WHO[40]推荐将其用于疑似TBM的初步检测。Bahr等[41]用Xpert Ultra检测成人并发HIV感染TBM患者的脑脊液，检测敏感度可达70%；而用Xpert和培养检测的敏感度均为43%。同时发现，检测的脑脊液体积越大，TBM检出率越高，如Xpert Ultra检测≥6 ml和<6 ml脑脊液的阳性率分别为26%和7%。Wang等[42]发现，用Xpert Ultra和Xpert同时检测含菌量少的痰、胸腔积液和脑脊液样本时，两者检测利福平耐药的效果相当，Xpert Ultra虽特异度略低(96.75%比98.37%)，但敏感度明显占优(44.19%比18.60%)。因此，Xpert Ultra和Xpert均具备自动化、快速的特点，但前者能检出更多的TBM患者。

另外，新的技术方法也不断尝试用于TBM的诊断。Li等[43]采用新一代微滴数字PCR技术检测脑脊液结核分枝杆菌IS6110核酸诊断TBM的总敏感度为57.4%(39/68)，特异度为97.0%(32/33)，敏感度显著高于Xpert、实时荧光定量PCR、分枝杆菌培养和涂片检测。Park等[44]首先采用同型双功能亚氨酸酯和微流控平台富集脑脊液中的结核分枝杆菌，然后再进行实时荧光定量PCR检测，检测敏感度可达100%，显著高于分枝杆菌培养(20%)和Xpert(0%)。最新Meta分析显示，核酸扩增检测(包括商业化试剂盒和处于研发阶段的检测)诊断TBM的总敏感度和特异度分别为82%(75%～87%)和99%(98%～99%)(以培养为标准)，或68%(41%～87%)和98%(95%～99%)(以临床表现加脑脊液抗酸杆菌阳性或培养阳性或核酸检测阳性为标准)，提示单独的核酸扩增检测目前尚不足以替代培养的方法，但可与培养联合使用以缩短检测时间，同时也可用于不具备培养条件的地区[45]。

(二)结核分枝杆菌抗原检测

除了LAM检测，研究者们也试图利用酶联免疫吸附试验(enzyme-linked immunosorbent assay, ELISA)、免疫组织化学等方法来直接检测脑脊液中的结核分枝杆菌抗原，如苹果酸合成酶G(GlcB)、热休克蛋白X(HspX)、Rv3803c、抗原85B(Ag85B)、周质磷酸结合脂蛋白1(PstS1)、早期分泌蛋白靶6(ESAT-6)、Rv2623等，但大多数准确性较差，无法应用于临床[46-48]。最近有研究评价了基于适配体检测结核分枝杆菌抗原的方法。例如，以HspX抗原为靶标的两种DNA适配体诊断TBM的敏感度分别为100%和95%，特异度分别为91%和97.5%[49-50]；以结核分枝杆菌苹果酸合成酶为靶标的MS10-Trunc适配体诊断TBM的敏感度和特异度均超过97%[51]，提示此类方法用以提高TBM诊断效率上有潜力。我国也有采用适配体检测结核分枝杆菌抗原[如带甘露糖帽的脂阿拉伯甘露聚糖Man-LAM、培养滤液蛋白(CFP-10)和ESAT-6]诊断结核病的研究，但对TBM的诊断价值如何还缺乏系统评估[52-53]。

(三)基因组测序检测

有研究用脑脊液宏基因组二代测序的方法检测TBM确诊患者，其敏感度和特异度分别为66.67%和100%，敏感度高于抗酸染色(33.33%)、PCR(25%)和分枝杆菌培养(8.33%)，该方法与传统方法联合诊断可使TBM的阳性检出率达95.65%[54]。

二、基于宿主的TBM标志物的发现

(一)免疫学检测标志物

由于基于细胞免疫的IGRA无法区分活动性结核病和潜伏性结核感染，一些研究者尝试发现新的结核分枝杆菌免疫原。Liu等[55]通过筛选1250个结核分枝杆菌蛋白，发现34个蛋白能够诱导肺结核患者外周血单个核细胞(peripheral blood mononuclear cell, PBMC)释放γ干扰素。Serra-Vidal等[56]发现Rv1733具有强免疫原性，用该蛋白刺激后进行IGRA检测，能区分未感染、潜伏性结核感染和活动性结核病三种不同的状态；同时发现Rv2389和Rv2435n也是潜伏性结核感染的候选标志物。也有一些研究从不同T细胞的功能和表型、细胞因子等方面寻找可区分结核分枝杆菌感染不同状态的标志物[57-62]，一个研究提示脑脊液白细胞介素(IL)-12p40、IL-13等可能对TBM诊断有一定意义[63]。但总体上，这些新标志物尚处于发现和验证阶段，对TBM的诊断价值尚缺乏评价。

在结核分枝杆菌抗体检测方面，Liu等[55]通过系统筛选发现了结核病患者血清中有29个结核分枝杆菌蛋白的抗体水平高于商业化的38 kDa(即相对分子质量为38 000)蛋白抗体水平，其中很多蛋白是首次报道，它们对TBM是否有诊断意义尚待评估。

(二)蛋白标志物

利用蛋白质组学技术陆续发现的TBM脑脊液蛋白标志物有花生四烯酸5脂氧合酶(arachidonate 5-lipoxygenase, ALOX-5)[64]、神经表皮生长因子样类似物2(neural epidermal growth factor-like like 2, NELL2)[65]、人脂类代谢蛋白ApoB等[66]。其中NELL2在TBM脑脊液中显著降低，其区分TBM与健康对照的敏感度和特异度分别为83.3%和75.0%[65]；ApoB在TBM脑脊液中明显升高，其区分TBM与健康人群和病毒性脑膜炎对照的敏感度和特异度分别为89.3%和92.0%[66]。也有研究评价了一些蛋白分子对TBM的诊断价值。例如，脑脊液高迁移率族蛋白1(high mobility group box-1, HMGB1)采用ELISA检测TBM的敏感度和特异度分别为61.02%和89.94%[67]。脑脊液热休克蛋白(heat shock protein, Hsp)70 和Hsp 90，采用ELISA检测TBM的敏感度分别为89%和88%，特异度分别为82%和89%[68]。另外，转化生长因子β[69]、基质金属蛋白酶9[70]、白三烯B4[71]等在TBM脑脊液中也明显升高，提示有潜在的辅助诊断意义。

对各种蛋白标志物进行联合检测也是提高TBM诊断效率的重要途径。脑脊液血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor, VEGF)、IL-13和抗菌肽LL-37三者联合诊断儿童TBM的敏感度和特异度分别为52%和95%[72]，而脑脊液VEGF、γ干扰素和髓过氧化物酶(myeloperoxidase, MPO)联合诊断儿童TBM的敏感度和特异度可分别提升至91.3%和100.0%[73]。

(三)微小核糖核酸(miRNA)标志物

有研究报道PBMC和脑脊液miR-29a诊断儿童TBM(以健康儿童为对照)的敏感度分别为67.20%和81.10%，特异度分别为88.50%和90.00%；两种样本联合检测的敏感度和特异度分别为84.40%和95.38%，表明miR-29a是儿童TBM诊断的潜在标志物[74]，但miR-29a能否区分TBM与其他类型脑膜炎和中枢神经系统疾病，以及对成人TBM有无诊断价值还需进一步研究。Pan等[75]通过全基因组miRNA微阵列筛选，发现了成人TBM患者PBMC样本中的4个miRNAs标志物(miR-126-3p，miR-130a-3p，miR-151a-3p和miR-199a-5p)，经独立样本验证该标志物组合区分TBM和病毒性脑膜炎的敏感度和特异度分别为81.8%和90.0%，区分TBM和其他非TBM疾病的敏感度和特异度分别为81.8%和84.6%。

(四)代谢标志物

临床上早已发现TBM患者通常脑脊液中氯化物和葡萄糖降低、乳酸升高，研究证明乳酸是宿主对感染反应的L-乳酸，而非细菌来源的D-乳酸[76]。近年来出现了一些应用代谢组学技术鉴定TBM代谢标志物的研究。Mason等[77]发现了16个有助于区分儿童TBM与非脑膜炎对照的代谢分子。Li等[78]筛选到25个有助于区分成人TBM和病毒性脑膜炎的代谢分子。van Laarhoven等[79]在TBM患者脑脊液中发现了250个升高和18个降低的代谢分子，而在血清中仅发现了5个差异性代谢分子，其中脑脊液色氨酸在TBM存活组中较死亡组和对照组中的浓度显著降低，提示脑脊液色氨酸代谢对TBM预后非常关键，采取靶向干预措施有可能会改善患者预后。

展 望

TBM是一种严重的结核病类型，快速确诊和及时治疗是提高患者生存率的关键，但现有的实验室检测方法敏感度低，经常所有检测结果均为阴性或仅有某一种检测结果阳性，几种方法同时阳性的比例较低，因此有必要联合多项检测以提高检出率。另外，由于TBM患者往往有中枢神经系统外的结核病灶，Riste等[80]建议有条件的地区应该采用胸部CT初筛，然后结合支气管镜检查、支气管灌洗液培养等手段积极寻找中枢神经系统外的结核病灶，这种策略联合Xpert Ultra等新型分子检测技术有望进一步改善对TBM的诊断现状。

除了利用和改进现有方法，研究者们也积极研发新技术和新标志物以提高TBM检出率。结核分枝杆菌分子检测仍将是未来研发的重点，而应用高通量技术筛选TBM诊断标志物也是研究热点。目前，新发现的标志物大多处于发现阶段，一些研究结果不一致或仅在某个研究中报道，尚缺乏在不同地区、不同人群、不同病程阶段和病情轻重不同的TBM患者中进行大样本验证，因而诊断价值如何还亟待做进一步评估。

与此同时，TBM实验室诊断研究仍面临着诸多问题和挑战。首先，评估新方法或新标志物的诊断价值时纳入标本十分困难。由于TBM发病率相对较低，能留取检测的脑脊液样本量有限，并且需要通过有创的腰椎穿刺获取，因此脑脊液标本获取非常困难，这使得许多研究的标本量很小，评估得到的诊断价值可靠性不高。其次，TBM纳入标准不统一导致研究结果很难进行平行比较。根据Marais标准TBM分为确诊(definite)、很可能(probable)和可能(possible)TBM三类[81]，而实际研究中有的仅纳入确诊TBM，有的纳入确诊和很可能TBM，有的则将所有可疑TBM全部纳入，还有的研究采用其他分类标准，因此已发表的为数不多的研究结果也很难用来直接比较。第三，不同研究采用的对照往往不一致，得到的结果可能差异较大，因此在比较和评价结果时需要慎重。除了非脑膜炎对照，其他类型的脑膜炎对照(如细菌性脑膜炎、病毒性脑膜炎、真菌性脑膜炎等)也有必要纳入。尽管对照设置越多研究难度越大，但研究的发现和结论会更加可靠。

总之，尽管TBM实验室诊断研究进展相对缓慢，也面临着各种困难和挑战，但新的研究和发现将带给我们希望。相信随着新标志物的发现、新方法的成熟，以及诊断价值的进一步明确，可以为TBM的早期诊断提供更强有力的工具。