基于主成分分析及聚类分析的王不留行UPLC指纹图谱研究

曹斯琼，罗宇琴，吴文平，杨文慧，索彩仙，李国卫

(广东一方制药有限公司/广东省中药配方颗粒企业重点实验室，广东 佛山 528244)

王不留行为石竹科植物麦蓝菜Vaccariasegetalis(Neck.) Garcke的干燥成熟种子，具有活血化瘀、下乳消肿、利尿通淋的功效[1]。味苦，性平，归肝、胃经。除了华南地区以外，全国各地区均有分布。据文献报道，王不留行的主要化学成分有黄酮苷、生物碱、三萜皂苷、环肽和挥发油等[2-4]。黄酮苷类成分是王不留行催乳的有效成分，具有促进乳汁分泌的作用[5]。另外，王不留行黄酮苷类成分还能保护血管内皮细胞，而刺桐碱能抗炎、增强免疫和抗肝损伤[6-7]。

王不留行作为常用中药材，具有较高的药用价值。目前，对王不留行的质量研究主要通过测定单一的成分含量对王不留行进行评价[8-9]。中药成分复杂，仅以单个指标的含量作为质量的评价指标是不全面的。中药指纹图谱是指中药材或中药制剂经适当处理后采用一定的分析手段，得到能够标示其化学特征的色谱图或光谱图[10]。2015年版《中国药典》仅收载了王不留行的性状、显微鉴别、薄层色谱鉴别及黄酮苷的含量测定等方法来评价王不留行药材的品质。《香港中药材标准》[11]则除了收载性状、显微鉴别、薄层色谱鉴别及王不留行环肽A的含量测定外，增加了HPLC指纹图谱的控制。本研究参考《香港中药材标准》王不留行项下的指纹图谱方法，建立王不留行UPLC指纹图谱方法，可同时测定刺酮碱的含量，并结合相似度分析、聚类分析和主成分分析，对不同产地的王不留行药材的质量进行评价。

1 仪器与材料

王不留行药材来源于全国不同的产地，经广东一方制药有限公司魏梅主任中药师鉴定为石竹科植物麦蓝菜Vaccariasegetalis(Neck.) Garcke的干燥成熟种子，具体来源见表1。

表1 王不留行药材来源Table 1 Sources information of Vaccariae Semen

Waters超高效液相色谱仪(沃特斯公司)；Agilent 超高效液相色谱仪(安捷伦公司)；YMC Trait C18(100 mm×2.1 mm，1.9 μm)色谱柱；ME204E万分之一天平(梅特勒-托利多公司)；XP26百万分之一天平(梅特勒-托利多公司)；KQ-500DE数控超声波清洗器(昆山市超声仪器有限公司)。

刺桐碱对照品(上海源叶生物科技有限公司，质量分数：98.0%，批号：P26N6F6550)；王不留行黄酮苷对照品(中国食品药品检定研究院，质量分数：99.7%，批号：111853-201704)；甲醇为分析纯，乙腈为色谱纯，水为超纯水(实验室自制)。

2 方法与结果

2.1 溶液的制备

2.1.1 对照品溶液 取刺桐碱对照品适量，精密称定，置25 mL量瓶中，加甲醇定容至刻度，摇匀，制得每1 mL含刺桐碱131.085 μg的储备液。精密量取刺桐碱储备液2.5 mL于10 mL量瓶中，加甲醇制成每1 mL含32.771 μg的溶液。

取王不留行黄酮苷对照品适量，精密称定，置20 mL量瓶中，加甲醇定容至刻度，摇匀，制得每1 mL含王不留行黄酮苷150.098 μg的溶液。

2.1.2 供试品溶液 取王不留行药材粉末(过三号筛)约1 g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入75%(体积分数，下同)乙醇25 mL，称定质量，超声处理(功率250 W，频率40 kHz)30 min，放冷，再称定质量，用75%乙醇补足减失的质量，摇匀，滤过，取续滤液，即得。

2.2 色谱条件

色谱柱：YMC Trait C18(100 mm×2.1 mm，1.9 μm)；流动相：乙腈(A)-水(B)，梯度洗脱(0～5.5 min，10%～15%A；5.5～11 min，15%～30% A；11～16.5 min，30%～70% A)；流速：0.35 mL/min；柱温：35 ℃；检测波长：219 nm；进样量：1 μL。

2.3 UPLC指纹图谱的建立

2.3.1 精密度试验 取S3号供试品溶液，按“2.2”项色谱条件，连续进样6次，记录色谱图，以王不留行黄酮苷峰为参比峰，计算各共有峰相对保留时间的RSD均小于1.0%，相对峰面积的RSD均小于1.0%，表明仪器精密度良好。

2.3.2 稳定性试验 取S3号供试品溶液，按“2.2”项下色谱条件分别在0、2、4、6、12 h进样，记录色谱图，以王不留行黄酮苷为参比峰，计算各共有峰相对保留时间的RSD均小于1.0%，相对峰面积的RSD均小于3.0%，结果表明供试品溶液在12 h内稳定。

2.3.3 重复性试验 取S3号样品粉末(过三号筛)6份，按“2.1.2”项下方法制备供试品溶液，分别精密吸取1 μL，按“2.2”项下色谱条件分析，记录色谱图，以王不留行黄酮苷为参比峰，计算各共有峰相对保留时间的RSD均小于1.0%，相对峰面积的RSD均小于1.0%，结果表明方法重复性良好。

2.4 王不留行药材指纹图谱的建立

2.4.1 共有峰的确定

取15批王不留行药材样品，按“2.1.2”项下方法制备供试品溶液，按“2.2”项下确定的色谱条件进样测定，使用《中药色谱指纹图谱相似度评价软件》对15批王不留行药材特征图谱进行共有峰标识，并生成对照图谱。结果见图1、图2。以2号峰为参照，各批样品的共有峰的相对保留时间见表2。可见，各共有峰较稳定，具有指纹图谱特征性，可初步定为王不留行药材的指标成分群。经与对照品对照，确认1号峰为刺桐碱峰，2号峰为王不留行黄酮苷峰。因王不留行黄酮苷峰分离效果好、出峰稳定，选定为参照峰。

90080070060050040030020010005432(s)1RS15S14S13S12S11S10S9S8S7S6S5S4S3S2S101234567891011121314151617t/minU/mV

1.刺桐碱； 2(s).王不留行黄酮苷。

图115批王不留行药材UPLC指纹图谱叠加图

Figure1Overlay chart of UPLC fingerprint of 15 batches of Vaccariae Semen

2.4.2 各产地药材指纹图谱相似度评价

以15批次王不留行药材生成的共有模式(S0)为对照指纹图谱，15批次王不留行药材与对照指纹图谱的相似度范围为0.987～1.000，各批次药材与对照指纹图谱的相似度均在0.98以上，说明各产地药材表现出了良好的相似度。不同产地王不留行药材的相似度较为接近，说明各产地王不留行药材质量稳定。结果见表3。

24022020018016014012010080604020012(s)543012345678910111213141516t/minU/mV

1.刺桐碱； 2(s).王不留行黄酮苷。

图215批王不留行药材UPLC指纹图谱共有模式

Figure2Total mode of UPLC fingerprint of 15 batches of Vaccariae Semen

表2 15批王不留行药材指纹图谱相对保留时间

Table2Relative retention time analysis of common peaks in 15 batches of Vaccariae Semen

编号峰1峰2峰3峰4峰5S10.457 1.000 1.266 1.512 1.891 S20.456 1.000 1.266 1.513 1.894 S30.458 1.000 1.264 1.508 1.884 S40.461 1.000 1.256 1.489 1.858 S50.462 1.000 1.256 1.487 1.854 S60.467 1.000 1.255 1.489 1.857 S70.460 1.000 1.223 1.433 1.770 S80.465 1.000 1.257 1.491 1.859 S90.460 1.000 1.224 1.434 1.772 S100.461 1.000 1.225 1.435 1.773 S110.462 1.000 1.255 1.485 1.852 S120.462 1.000 1.256 1.486 1.853 S130.467 1.000 1.255 1.487 1.854 S140.467 1.000 1.255 1.486 1.852 S150.468 1.000 1.255 1.486 1.852

表3 15批王不留行药材指纹图谱相似度评价

Table3Similarity of fingerprints of 15 batches of Vaccariae Semen

编号相似度编号相似度S10.987 S90.998 S20.996 S100.999 S30.997 S110.995 S41.000 S121.000 S50.997 S130.999 S60.999 S140.998 S71.000 S150.998 S81.000 S01.000

2.4.3 王不留行样品聚类分析

将各色谱峰峰面积相对于称样量进行量化，运用SPSS 20.0软件对15批王不留行药材样品进行系统聚类，采用组间平均数联结法，以夹角余弦作为样品相似度的距离公式。聚类分析将王不留行药材样品分为4类，Ⅰ类包括S3、S4、S5、S6、S11、S12、S13、S14、S15，即安徽样品与3批河北及1批河南样品聚为一类；Ⅱ类包括S8、S10，即2批河南样品聚为一类；Ⅲ类包括S7、S9，即2批河北的样品聚为一类；Ⅳ类包括S1、S2，即甘肃的样品聚为一类；总体看来，河北、河南和安徽的王不留行药材质量大体相近，不同来源的样品亦能聚到一类，说明不同产地的样品质量差异不大，与相似度分析的评价结果相一致。结果见图3。

1015202505S13S14S5S12S3S15S4S6S11S8S10S7S9S1S2

图315批王不留行药材样品聚类分析结果

Figure3Dendrogram of clustering analysis of 15 batches of Vaccariae Semen

2.4.4 主成分分析

2.4.4.1 共有峰主成分分析

主成分分析(PCA)是一种通过降维技术把多个变量化为少数几个主成分的统计方法，利用SPSS20.0软件对15批王不留行指纹图谱所得的5个共有峰进行主成分分析，得出相关矩阵的特征值及其方差，见表4。可见，前2个主成分对总方差的累积贡献率达89.115%，故选择主成分数为2，可代表王不留行指纹图谱共有峰的大部分信息，说明前2个主成分的分析结果基本显示出了不同批次王不留行药材之间的相似度和差异性。

表4 主成分特征值及贡献率结果 Table 4 Eigen value and contribution rate of principal component analysis主成分特征值贡献率/%累积贡献率/%13.41368.25068.25021.04320.86589.11530.2625.24894.36340.2054.10498.46750.0771.533100.000

2.4.4.2 不同产地王不留行药材的综合评价

针对前2个主成分对王不留行药材进行综合评价，按方差贡献率加权计算综合得分，结果见表5。可见，排名前3的3批样品均为河北产的样品；排名前6的样品中，河北的4批、河南的1批、安徽的1批。总体来说，甘肃产地的王不留行药材质量较差，综合排名倒数；河北和河南产地的王不留行整体上质量较优且稳定。

另外，对15批不同产地的王不留行样品的前2个共有峰(刺桐碱、王不留行黄酮苷)的质量分数进行测定，结果发现甘肃产地的2批样品中，刺桐苷和王不留行黄酮苷质量分数均较低，分别为0.11%、0.10%和0.44%、0.40%，表明甘肃产王不留行药材整体质量较差，与指纹图谱结果一致。

表5 15批王不留行药材综合得分排序表Table 5 Sorting table of integrated scores of 15 batches of Vaccariae Semen

3 讨论

本研究分别考察了Waters HSS T3色谱柱(100 mm×2.1 mm，1.6 μm)、YMC Trait C18色谱柱(100 mm×2.1 mm，1.9 μm)、Waters BEH C18色谱柱(100 mm×2.1 mm，1.6 μm)3种色谱柱，经比较发现YMC Trait C18色谱柱(100 mm×2.1 mm，1.9 μm)的分离效果最好，峰型更好。考察了乙腈-0.1%磷酸、乙腈-0.1%醋酸、乙腈-水、甲醇-水4种流动相体系，结果发现乙腈-水分离效果最好。采用PDA检测器进行全波长扫描，比较了219、280、310 nm波长下各色谱峰的响应，结果发现219 nm波长下基线平稳，峰信息量较大，各色谱峰峰型较好，故选择219 nm作为王不留行药材指纹图谱检测波长。考察了33、35、37 ℃ 3个柱温对王不留行指纹图谱的影响，结果发现3个柱温对王不留行药材指纹图谱相对保留时间基本无影响。考察了0.18、0.20、0.22 mL/min 3种微小流速的变动对王不留行药材指纹图谱的影响，以相对保留时间、相对峰面积为指标，结果发现，此方法下流速±0.02 mL/min对王不留行药材指纹图谱基本无影响，说明流速微小的变动能满足系统适应性要求。

本研究运用相似度分析、聚类分析对不同产地的王不留行药材UPLC指纹图谱进行分析，15批王不留行药材的指纹图谱相似度在0.98以上，说明不同产地的王不留行药材质量比较一致。聚类分析将王不留行药材样品分为4类，Ⅰ类包括S3、S4、S5、S6、S11、S12、S13、S14、S15，即安徽样品与3批河北及1批河南样品聚为一类；Ⅱ类包括S8、S10，即2批河南样品聚为一类；Ⅲ类包括S7、S9，即2批河北的样品聚为一类；Ⅳ类包括S1、S2，即甘肃的样品聚为一类，总体看来，河北、河南和安徽的王不留行药材质量大体相近，但不同来源的样品亦能聚到一类，说明不同来源的样品质量差异不大，与相似度分析的评价结果相一致。

本研究运用指纹图谱分析方法，较全面地评价了不同产区的王不留行药材的质量，可为王不留行药材的质量控制提供参考。