行气温中颗粒的UPLC指纹图谱及含量测定研究

香志豪，孙冬梅，胥爱丽，毕晓黎，江洁怡，曾志浩，罗思妮

[1.广州中医药大学第五临床医学院,广东 广州510095; 2.广东省中医药工程技术研究院(广东省中医药研究开发重点实验室),广东 广州 510095]

行气温中颗粒是广东省第二中医院内部制剂，由姜厚朴、橘红、炙甘草、草豆蔻、薏苡仁、金钱草组成，具有温中行气、散寒、燥湿、除满之功效，临床上常用治脾胃寒湿气滞、脘腹冷痛等症[1]。方中厚朴为君药，功能温中益气、下气除满[2]；橘红、草豆蔻、金钱草并为臣药，有行气化湿之功效[3-4]；佐以薏苡仁利水渗湿；炙甘草为使药，可调和药性。方中药味，如厚朴，现代药理学研究表明其主要成分和厚朴酚与厚朴酚具有抗感染、抑菌、镇痛、抗肿瘤的作用[5]；橘红中主要成分橙皮苷具有抗溃疡作用[6]；甘草中主要成分甘草酸铵具有对胃肠道平滑肌的抑制作用[7]；草豆蔻中主要成分山姜素对胃黏膜有保护作用，可提高胃蛋白酶活性[8]。本文以行气温中颗粒君臣药中的主要成分为指标性成分，采用超高效液相色谱法同时对芸香柚皮苷、橙皮苷、山姜素、甘草酸铵、厚朴酚、和厚朴酚6种成分进行质量分数测定，从而可以更全面、更有效控制其质量。

1 仪器与试药

Agilent 1290高效液相色谱仪(美国安捷伦科技有限公司)；TLE204电子分析天平(十万分之一，梅特勒-托利多仪器有限公司)；KQ700-DE数控超声波清晰机(江苏昆山市超声仪器有限公司)；Milli-AQdevantageA10自动型纯水机(德国默克公司)。

和厚朴酚对照品(批号：110730-201614，质量分数：99.3%)、厚朴酚对照品(批号：110729-200309，质量分数：98.8%)、甘草酸铵对照品(批号：111610-201607，质量分数：97.7%)、橙皮苷对照品(批号：110721-201115，质量分数：95.3%)、山姜素对照品(批号：762-9202，质量分数：99.2%)均购自中国食品药品检定研究院。芸香柚皮苷对照品(批号：4-071-180917，质量分数：99%)购自成都瑞芬思生物科技有限公司。行气温中颗粒由广东省第二中医院制剂室提供，批号分别为190701(S1)、190702(S2)、190703(S3)、190704(S4)、190705(S5)、190706(S6)、190707(S7)、190708(S8)、190709(S9)、190710(S10)、190711(S11)、190712(S12)、190713(S13)、190714(S14)、190715(S15)。

乙腈为色谱纯；水为超纯水；其余均为分析纯。

2 方法与结果

2.1 行气温中颗粒指纹图谱的建立

2.1.1 色谱条件 色谱柱：Waters UPLC CORTECS T3C18色谱柱(2.1 mm×150 mm，1.6 μm)；流动相：乙腈(A)-0.2%H3PO4水溶液(B)，梯度洗脱(0～25 min，10%A→20%A；25～40 min，20%A→35%A；40～55 min，35%A→60%A；55～65 min，60%A→70%A；65～80 min，70%A→95%A)；流速：0.2 mL/min；柱温：30 ℃；检测波长254 nm；进样量：2 μL。

2.1.2 供试品溶液的制备 取行气温中颗粒约0.25 g，精密称定，置50 mL具塞锥形瓶中，精密加入50%(体积分数，下同)甲醇10 mL，称定质量，超声(700 W，50 kHz)处理30 min，放冷，用50%甲醇补足减失的质量，过0.22 μm微孔滤膜，取续滤液，作为供试品溶液。

2.1.3 对照品溶液的制备 分别取芸香柚皮苷、橙皮苷、甘草酸铵、山姜素、厚朴酚、和厚朴酚对照品适量，加甲醇制成6种成分质量浓度分别为0.239 4、0.507 0、0.171 2、0.069 5、0.214 0、0.242 8 mg/mL的对照品溶液。

2.1.4 精密度试验 取同一批行气温中颗粒(S1)，按“2.1.2”项下方法制备供试品溶液，并按“2.1.1”项下色谱条件连续进样6次。以8号厚朴酚色谱峰为参照峰(S)，计算得到各共有峰相对峰面积及相对保留时间的RSD值均小于2.0%，表明仪器精密度良好。

2.1.5 重复性试验 取同一批行气温中颗粒(S1)，按“2.1.2”项下方法平行制备6份供试品溶液，并按“2.1.1”项下色谱条件依次进样测定，以8号厚朴酚色谱峰为参照峰(S)，计算得到各共有峰相对峰面积和相对保留时间的RSD值均小于2.5%，表明方法重复性良好。

2.1.6 稳定性试验 取同一批行气温中颗粒(S1)，按“2.1.2”项下方法制备供试品溶液，按“2.1.1”项下色谱条件分别于0、2、4、8、10、12、24 h进样测定，以8号厚朴酚色谱峰为参照峰(S)，计算得到各共有峰相对峰面积和相对保留时间的RSD值均小于2.5%，表明供试品溶液在24 h内稳定性良好。

2.1.7 UPLC指纹图谱的建立 取15批行气温中颗粒，按“2.1.2”项下方法制备供试品溶液，并按“2.1.1”项下色谱条件测定。采用“中药色谱指纹图谱相似度评价软件系统(2004 A版)”进行指纹图谱分析，采用多点校正后进行自动匹配(时间窗为0.1 min)，提取吸收信号较强、峰形明显、稳定性较好的共有峰，用中位数法生成对照指纹图谱，结果见图1～2。

根据数据分析，标定了8个共有特征色谱峰，其中1、2、3、5、7、8号峰分别鉴定为芸香柚皮苷、橙皮苷、山姜素、甘草酸铵、和厚朴酚、厚朴酚。15批行气温中颗粒样品色谱图与对照指纹图谱相似度分别为0.945、0.947、0.915、0.963、0.969、0.965、0.961、0.955、0.982、0.952、0.920、0.969、0.961、0.967、0.992。15批供试品相似度均大于0.9，共有峰分离度、峰形良好。

U/mV15001200900600300010203040506070800t/minS15S14S13S12S11S10S9S8S7S6S5S4S3S2S1

S1～S15.S1～S15号行气温中颗粒； 1.芸香柚皮苷； 2.橙皮苷； 3.山姜素； 5.甘草酸铵； 7.和厚朴酚；8.厚朴酚。

图115批行气温中汤颗粒的UPLC叠加图谱

Figure1The UPLC overlay fingerprints of 15 batches Xingqiwenzhong granules

10203040506070800t/min2101801501209060300S1(16)U/mV

1.芸香柚皮苷； 2.橙皮苷； 3.山姜素； 5.甘草酸铵； 7.和厚朴酚；8.厚朴酚。

图215批行气温中颗粒的对照图谱

Figure2The reference fingerprint of 15 batches Xingqiwenzhong granules

2.2 含量测定

2.2.1 色谱条件及供试品、对照品溶液的制备 分别同“2.1.1”、“2.1.2”、“2.1.3”项下方法。

2.2.2 对照品溶液及样品的测定 分别精密吸取各对照品、行气温中颗粒(S1)供试品溶液2 μL，按“2.1.1”项下色谱条件进样测定，色谱图见图3。

2.2.3 线性关系的考察 分别精密吸取“2.1.3”项下芸香柚皮苷、橙皮苷、甘草酸铵、山姜素、厚朴酚、和厚朴酚对照品溶液适量，分别置10 mL容量瓶中，用甲醇稀释至刻度，摇匀，分别制得6种对照品系列质量浓度的对照品溶液。各对照品质量浓度如下：芸香柚皮苷(0.239 4、0.191 5、0.1435、0.071 8、0.023 94 mg/mL)，橙皮苷(0.507、0.405 6、0.253 5、0.152 1、0.101 4 mg/mL)，山姜素(0.069 5、0.041 7、0.027 8、0.020 85、0.003 475 mg/mL)，甘草酸铵(0.171 2、0.128 4、0.064 2、0.042 8、0.021 4 mg/mL)，和厚朴酚(0.242 8、0.121 4、0.060 7、0.024 28、0.012 14 mg/mL)，厚朴酚(0.214、0.128 4、0.085 6、0.042 8、0.021 4 mg/mL)。分别精密吸取2 μL，注入液相色谱仪，按“2.1.1”项下色谱条件进行测定。以对照品质量浓度(ρ)为横坐标，峰面积(A)为纵坐标，绘制标准曲线，计算回归方程。结果见表1。

12080400102030405060700t/minBACDEGF120804001208040012080400102030405060700t/minU/mVU/mVU/mVU/mV

1.芸香柚皮苷； 2.橙皮苷； 3.山姜素； 4.甘草酸铵； 5.和厚朴酚；6.厚朴酚。A.供试品； B.芸香柚皮苷对照品； C.橙皮苷对照品；D.山姜素对照品；E.甘草酸铵对照品；F.和厚朴酚对照品；G.厚朴酚对照品。

图3行气温中颗粒(S1)、各对照品的UPLC色谱图

Figure3The chromatograms of Xingqiwenzhong granules and reference substance

2.2.4 精密度试验 取同一批行气温中颗粒(S1)，按“2.1.2”项下方法制备供试品溶液，按“2.1.1”项下色谱条件连续进样6次，计算得到芸香柚皮苷、橙皮苷、山姜素、甘草酸铵、厚朴酚、和厚朴酚峰面积的RSD值分别为1.34%、1.54%、1.82%、1.27%、1.77%、1.65%，表明仪器精密度良好。

表1 6种成分线性关系考察结果Table 1 The results of the linear relationship of the six components (n=2)

2.2.5 重复性试验 取同一批行气温中颗粒供试品(S1)，按“2.1.2”项下方法平行制备6份供试品溶液，按“2.1.1”项下色谱条件测定，计算得到芸香柚皮苷、橙皮苷、山姜素、甘草酸铵、厚朴酚、和厚朴酚质量分数的RSD值分别为1.93%、1.96%、1.25%、2.46%、1.58%、2.18%，表明方法重复性良好。

2.2.6 稳定性试验 取同一批行气温中颗粒(S1)，按“2.1.2”项下方法制备供试品溶液，按“2.1.2”项下色谱条件分别于0、2、4、8、10、12、24 h进样测定，计算得到芸香柚皮苷、橙皮苷、山姜素、甘草酸铵、厚朴酚、和厚朴酚峰面积的RSD值分别为1.34%、1.54%、1.82%、1.77%、1.62%、1.86%，表明供试品溶液在24 h内稳定性良好。

2.2.7 加样回收率试验 取同一批行气温中颗粒(S1)6份，每份约0.125 g，精密称定，分别置50 mL具塞锥形瓶中，加入各对照品溶液适量，分别按“2.1.2”项下方法制备供试品溶液，按“2.1.1”项下色谱条件依次测定。计算得到芸香柚皮苷、橙皮苷、山姜素、甘草酸铵、厚朴酚、和厚朴酚的平均加样回收率分别为100.15%、100.24%、99.86%、98.68%、99.60%、99.98%，结果见表2。

2.2.8 样品测定 取15批行气温中颗粒，按“2.1.2”项下方法制备供试品溶液，按“2.1.1”项下色谱条件测定，计算样品中芸香柚皮苷、橙皮苷、山姜素、甘草酸铵、厚朴酚、和厚朴酚的质量分数，结果见表3。

表2 行气温中颗粒中6种成分的加样回收率试验结果Table 2 The recoveries of six components in Xingqiwenzhong granules (n=6)

表2 (续)

表3 15批行气温中颗粒中6种成分质量分数测定结果

Table3The determination results of 15 batches Xingqiwenzhong granules (n=2)w/%

批号芸香柚皮苷 橙皮苷山姜素甘草酸铵和厚朴酚厚朴酚S10.314.410.100.290.060.28S20.653.620.230.220.250.18S30.824.710.250.270.150.22S40.134.480.090.230.130.14S50.774.360.170.280.190.21S60.293.070.120.380.110.10S70.582.530.110.320.110.15S80.333.520.130.200.080.30S90.093.510.100.220.210.28S100.154.380.120.140.080.17S110.093.880.150.200.080.16S120.563.200.140.220.100.21S130.093.860.090.180.120.21S140.593.370.130.400.090.12S150.153.690.100.260.110.15

3 讨论

将行气温中颗粒供试品溶液于190～400 nm紫外-可见光处进行全波长扫描，发现在254 nm处各色谱峰的数目、丰度、分离程度较好，最为适合指纹图谱研究，故本研究选择254 nm为检测波长。在寻找最佳的色谱条件过程中，本试验考察了不同提取方式(超声处理、加热回流)、不同提取溶剂(甲醇、70%甲醇、50%甲醇、乙醇、水)、不同提取时间(30、45、60 min)、不同柱温(20、25、30 ℃)、不同流速(0.1、0.2、0.3 mL/min)、不同流动相体系(乙腈-水、乙腈-0.2%甲酸溶液、乙腈-0.2%H3PO4溶液)和不同色谱柱(Phenomenex Luna Omega Polar C18柱、Agilent Poroshell 120 EC C18柱、Waters UPLC CORTECS T3C18)的效果。通过结果对比，发现超声与加热回流结果并无明显差异；50%甲醇作为提取溶剂时较其余提取溶剂提取更完全，提取液成分更丰富；提取时间分别为30、45、60 min时结果一致，无明显差异；选择乙腈-0.2%H3PO4溶液因为其对峰形改善好，且对峰的分离度较其余2种流动相好；Waters UPLC CORTECS T3C18柱对图谱分离效果好，且峰形较其余色谱柱更好。综合以上结果，最终确定了最佳提取方式及色谱条件。

本试验建立的行气温中颗粒UPLC指纹图谱，各峰分离度良好。各批次间的相对峰面积存在差异，可能于各批次间投料药材不同有关。

本试验建立同时测定芸香柚皮苷、橙皮苷、山姜素、甘草酸铵、厚朴酚、和厚朴酚6种成分的方法，对全面控制行气温中颗粒的质量具有指导意义。