中性粒细胞胞外诱捕网促进肿瘤局部生长

夏 杰，倪 浩，汤 静，胡 倩

( 黄冈职业技术学院 医药学院，湖北 黄冈 438002)

中性粒细胞是人体防御机制的第一道防线，是机体发挥天然免疫功能的主要细胞。中性粒细胞缺乏的患者免疫功能严重缺失，往往在年轻时死于细菌或真菌感染。然而中性粒细胞过度活化可导致大量活性氧和促炎细胞因子等细胞毒性介质的释放，可直接或间接损伤内皮细胞，导致细胞死亡[1]。2004 年，Brinkmann V[2]等发现了一种新的中性粒细胞防御机制，当病原体入侵时，中性粒细胞释放出网状结构的物质，将病原体捕获并杀灭。这种网状结构称为中性粒细胞胞外诱捕网(neutrophil extracellular traps ，NETs)，其化学组成主要是染色质DNA 和蛋白质。DNA 是NETs 的基本骨架，多种蛋白质充斥其中，如组蛋白和胞内颗粒释放出来的各种抗菌肽[3]。网状骨架可以限制捕获病原体，各种蛋白参与杀灭病原体。NETs 形成常伴随细胞的死亡，这一过程称为NETosis。这种死亡不同于凋亡和坏死，其最显著的特点是细胞核核膜的崩解，染色质的膨胀和去致密作用[3]。NETs 起初被单纯的认为是中性粒细胞诱捕和杀死病原体的一种手段，然而后来发现过度的NETs 形成还参与许多疾病的病理过程，如血栓形成、子痫前期、慢性炎症性疾病以及心肌梗死后的缺血再灌注损伤等。 然而，近年来还发现NETs 与恶性肿瘤的发生和发展有关，这也成为癌症研究中的一个新的热点。Ho-Tin-Noe B 等[4]在Lewis 肺癌小鼠模型身上的一项研究显示有肿瘤相关的中性粒细胞以及细胞外染色质在肿瘤组织中积累，提示肿瘤中存在NETs 形成。2013 年Berger-Achituv S 等[5]在一个基于小样本尤文氏肉瘤的研究中观测到，肿瘤组织内NETs 水平升高的患者预后较差，这是NETs与人类癌症恶化相关的第一个证据。我们知道NETs 的成分除了染色质DNA 外，还有包括众多种类蛋白质，如组蛋白和各种胞内颗粒释放蛋白。许多研究证实这些蛋白质与肿瘤的发生、发展有关。本文将重点讨论NETs 及其产物在肿瘤局部生长和进展中的作用相关研究的最新进展。

1 中性粒细胞弹性蛋白酶（NE）

NE 主要储存在于中性粒细胞嗜天青颗粒中，当中性粒细胞进入NETosis 程序时，NE 随着NETs 一起释放出来。NE 是一种强效广谱蛋白酶，有许多底物，包括细胞外几乎所有基质蛋白。Kolaczkowska E 等[6]对血液感染耐甲氧西林金黄色葡萄球菌小鼠模型的肝脏进行了研究，结果显示NE 结合于NETs，并展示出较强的蛋白水解活性和组织损伤效应。Houghton AM 等[7]观测了NE缺陷和非NE 缺陷的肺腺癌小鼠模型，发现NE缺陷小鼠肿瘤负荷及死亡率显著降低，并证实NE 可进入肿瘤细胞内体间室，通过降解胰岛素受体底物-1 (IRS-1)直接诱导人类和小鼠肺腺癌的肿瘤细胞增殖。Wada Y 等[8]通过MTT 比色法证明了NE 促进食管细胞增值，并通过细胞迁移实验证明了NE 可以增强食管细胞的侵袭性。 他们在食管癌细胞培养体系中加入外源性NE，发现细胞培养体系中转化生长因子-α（TGF-α）、血管内皮生长因子（VEGF）和血小板源生长因子（PDGF）的浓度显著增加，而这些因子可以促进食管癌细胞的增殖和迁移。一种特殊的NE抑制剂西维来司钠（Sivelestat）可以抑制这一现象。这些结果表明，活化中性粒细胞释放的NE通过生长因子刺激食管癌细胞的生长和进展，而特异性NE 抑制剂sivelestat 可以阻断这些过程。Gaida MM 等[9]在胰腺导管腺癌细胞与多形核白细胞共培养过程中也观察到NE 对肿瘤细胞迁移有促进作用。因此，有学者建议将Sivelestat 作为一种新的分子靶向癌症治疗手段。

2 基质金属蛋白酶9（MMP-9）

除了NE，NETs 的其他成分也与肿瘤进展、肿瘤相关炎症和血管生成有关。MMP-9 就是研究得较深入的例子之一。MMP-9 属于基质金属蛋白酶超家族成员中明胶酶的一种,又称明胶酶B，由包括中性粒细胞在内的多种细胞类型表达。MMP-9 储存在中性粒细胞的三级颗粒中，当中性粒细胞进入NETosis 程序时，MMP-9 可随着染色质DNA 释放出来。其主要功能是降解和重塑细胞外基质, 在伤口愈合、细胞迁移或血管生成过程中发挥着重要作用。另外MMP-9 也参与人体许多病理过程，Martinod K 等[10]通过观测脓毒症小鼠模型的相关数据，发现MMP-9 缺陷对小鼠内毒素休克具有保护作用。更重要的是，MMP-9 还与肿瘤的局部生长有关，Acuff HB 等[11]将Lewis 肺癌肿瘤细胞接种至野生型和MMP-9缺陷小鼠体内，结果发现， MMP-9 缺陷小鼠肿瘤细胞负荷相对于野生型低81%；他们还通过生物荧光成像技术检测了MMP-9 缺陷对小鼠肿瘤负荷影响的时间效应，结果显示，肿瘤细胞注入MMP-9 缺陷小鼠6 小时以内肿瘤细胞凋亡率是对照组的4 倍。Coussens LM 等[12]利用HPV16 致癌基因诱导的小鼠皮肤癌模型研究了MMP-9 对肿瘤的影响，结果显示MMP-9 在血管异常增生和侵袭性表皮癌的小鼠模型中显著上调，而MMP-9 缺陷小鼠肿瘤细胞的增殖、侵袭、转移均有所降低。这些数据表明，MMP-9 有助于肿瘤的发生、生长、进展以及肿瘤的侵袭和转移。Bergers G 等[13]很早就发现，胰岛癌变转基因小鼠模型MMP-9 上调，并通过释放VEGF 促进胰岛癌血管生成。而且，MMP-9 抑制剂可减少血管生成和肿瘤数量。因此，MMP-9 似乎对细胞外基质释放VEGF 非常重要，从而促进肿瘤的血管生成开关的开启。

以上研究多为单纯MMP-9 对肿瘤的效应，但与NETs结合的MMP9 是否也能传递这些效应，还需要进一步研究。

3 白细胞介素8（IL-8）

中性粒细胞能够产生大量的细胞因子,包括TNFα、IL-12 或IL-8。Gupta AK 等[14]很早就证实IL-8 可以激活子痫前期患者的中性粒细胞并引发NETosis 和NETs 形成。 他们后期的另外一项研究，中性粒细胞与内皮细胞的相互作用对NETosis 的影响，发现IL-8 与NETs 形成、血管生成以及中性粒细胞的募集密切相关[15]。Wang J等[16]将间充质干细胞(MSCs)与结肠癌细胞共培养，发现IL-8 在间充质肝细胞的表达高度上调。他们发现间充质细胞分泌的IL-8 促进人脐静脉内皮细胞(HUVEC)的增殖和迁移，进而促进了内皮细胞成管能力和结肠癌细胞的生长能力。另外，已知IL-8 与其受体CXCR1/2 之间的交互作用在癌症的发生、发展过程中起着重要作用。Reparixin 和SCH527123 是CXCR1/2 高效拮抗剂，Shengling Fu 等[17]发现Reparixin 或SCH527123 对多种人胰腺癌细胞株产生了剂量依赖性的生长抑制作用。因此，IL-8 支持实体肿瘤的生长也已得到共识，由于NETs 本身就会创造促炎环境，募集更多的中性粒细胞，而形成新的NETs，释放更多的IL-8，从而构成一个恶性循环，进行性促进血管生成和肿瘤生长。

4 粒细胞集落刺激因子（G-CSF）

Demers M 等[18]早已提出肿瘤可通过释放G-CSF 激发中性粒细胞形成NETs，并在在肿瘤微环境中检测到NETs 的存在。肽酰基精氨酸脱亚氨酶4（PAD4）催化染色质组蛋白瓜氨酸化，进而染色质解凝，这是NETs 形成的关键环节。Demers M 等[19]在后期又进行了一项实验，他们利用pad4 缺陷小鼠模型实验证实，G-CSF 通过激发中性粒细胞启动NETosis 程序促进肿瘤生长，并发现只有当肿瘤细胞产生G-CSF 时，PAD4 缺陷才能阻止肿瘤的进展。颜彬等[20]最近的一项研究证实，G-CSF 能够激活荷瘤小鼠骨髓中性粒细胞形成NETs，并促进U14 宫颈癌血管生成和肿瘤的生长；阻断G-CSF 作用，荷瘤小鼠骨髓中性粒细胞促瘤作用消失，如果用DNA 酶Ⅰ干扰NETs 形成，仅能部分消除荷瘤小鼠骨髓中性粒细胞促瘤作用。因此，G-CSF 可能是通过多途径发挥其促瘤作用。

综上所述，NETs 虽然是中性粒细胞发挥其天然免疫的重要手段，但在肿瘤免疫方面却表现出更多的促肿瘤作用，NETs 及其相关产物通过各种途径促进肿瘤的生长。随着这些作用机制不断阐明，我们对肿瘤的天然免疫应答机制的认识也不断深入，并为设计新的抗肿瘤治疗策略提供理论依据。