基于RNA 测序研究人参二醇对大鼠心血管内皮细胞基因表达的影响

郭冬阳 洪秀芳 沈灵芝 毛根祥 杨舟鑫

内毒素，即脂多糖（lipopolysaccharide，LPS），是革兰阴性菌细胞壁的主要成分，它作为一种重要的病原相关分子模式（pathogen-associated molecular pattern，PAMPs）被免疫细胞表面的模式识别受体（pattern recognition receptor，PRRs）识别后，会激活下游信号通路，引起宿主细胞炎症因子的产生和释放，过量的炎症因子释放会导致一系列炎症性疾病的发生，甚至脓毒症或脓毒症休克[1-2]。心脏微血管内皮细胞（cardiac microvascular endothelial cells，CMECs）与体内其他组织的内皮细胞类似，具有屏障、物质转运、抗凝、促凝、调节血管收缩等作用，其功能障碍导致的血管通透性改变被认为是LPS 感染引起心肌损伤的关键环节之一[3-4]。人参属伞形目五加科，作为传统中药材，自古就被誉为“百草之王”，有研究证明人参的肉质根可用于调整血压、恢复心脏功能、神经衰弱及身体虚弱等症。人参二醇（20 R-panaxadiol，PD）是人参、三七、西洋参、绞股蓝等药用植物中皂苷类物质的主要苷元，其分子量极小，更利于机体吸收发挥药理活性[5]。有研究表明，PD 能够有效抑制肿瘤细胞增殖，被认为是极具前景的抗癌药物[6-7]。但是它在内毒素引起的CMECs 损伤中是否发挥一定作用及其相关分子机制还鲜有报道。本研究中采用LPS 和LPS 联合PD 处理大鼠CMECs，利用转录组测序（RNA-seq）技术检测细胞转录组变化，并采用定量PCR 对部分差异基因进行验证，旨在研究LPS 感染状态下，PD 对CMECs 基因表达的影响，筛选出差异表达基因和相关信号通路，探讨PD 在LPS 引起的心血管内皮细胞损伤中的作用，现报道如下。

1 材料和方法

1.1 实验动物和试剂 SD 大鼠购买并饲养于浙江省医学科学院实验动物中心，月龄1～2 个月，体重100～150g。DMEM 培养基、胎牛血清购自美国Gibco公司；Ⅱ型胶原酶、0.25%胰蛋白酶购自美国Sigma公司；内皮生长因子购自美国PeproTech 公司。实验操作均得到浙江省医学科学院伦理委员会批准。

1.2 方法

1.2.1 细胞分离及培养 SD 大鼠麻醉后通过腹腔注射肝素抗凝20min，消毒后取出心脏组织，用D-Hanks 液洗涤数次；去除左右心房、室间隔和右心室，浸入75%乙醇中20～30s，之后剪除左心室游离壁外部约1/4 及心内膜，剩余心肌组织充分减碎至约1mm3小块，D-Hanks 洗涤2 次后，加入约1ml 0.2%Ⅱ型胶原酶，置于37℃水浴中孵育30min；再加入等体积的0.02%胰酶，轻轻吹打后37℃震荡孵育20min，至大部分组织块消化完全。最后，加入含20%血清的培养液终止消化，经200 目筛网过滤，4℃条件下，1 000r/min 离心5min，D-Hanks 洗涤后收集细胞。收集的CMECs 用完全培养基（含20%胎牛血清及生长因子）重悬后接种于10cm 培养皿中，4h 后弃去未贴壁细胞。贴壁的CMECs 用于后续实验。

1.2.2 RNA 提取和测序 原代CMECs 接种于6 孔板中，分别用LPS（100ng/ml）（LPS 组） 或LPS（100ng/ml）+PD（10μg/ml）处理（LPS+PD 组），每组3个复孔，6h 后收集细胞，Trizol 法提取总RNA，并进行质量控制。按照美国Illumina 生物技术公司RNA-seq 样本制备试剂盒（mRNA-Seq sample preparation kit）说明构建cDNA 文库。对照大鼠的基因组信息和完整的转录组信息，将测序出的reads比对到参考基因组上，进而对基因或转录本进行注释和定量。将reads 比对到基因组后，采用StringTie（2016）对表达进行注释和定量。StringTie 应用网络流算法和可选的denovo 组装，将复杂的数据集组装成转录本。进一步计算基因和转录本的FPKM 值（每百万外显子片段碱基映射获得的基因表达）。

1.2.3 差异转录本分析 利用Ballgown 对两个不同处理组进行比较，得到P值、Q值和转录本间的差异倍数（fold-change）；本研究中将两组进行比较，进行差异基因筛选，筛选条件为P＜0.05 和Fold change＞1.5 倍及＜0.66667 倍。

1.2.4 GO 功能类别及通路富集分析 GO 数据库用树状分层的方式对基因及蛋白功能进行详细描述，阐明了基因功能之间的层次关系。并将基因功能分为：分子功能（molecular function）、生物学过程（biological pathway）和细胞成分（cellular component）3 个类别。KEGG（kyoto encyclopedia of genes and genomes）是系统分析基因及其编码产物间关系、基因功能、基因组信息的数据库，信号通路分析（Pathway 分析）是基于KEGG 数据库，对差异基因利用Fisher 精确检验和χ2检验，将目标基因参与的通路进行统计学分析，按照P＜0.05 进行筛选，筛选出显著性差异的信号通路。

1.2.5 定量PCR 验证 将测序的RNA 样本逆转录为cDNA，对趋化因子配体（chemokine ligand，CCL）-11、白介素（interleukin，IL）-22、IL-17、基质金属蛋白酶（matrix metalloproteinase，MMP）-9 和表皮生长因子（epidermal growth factor，EGF）5 个基因进行定量PCR验证，定量PCR 使用SYBR R Premix ExTaq 进行分析，目的基因的mRNA 表达量均以β-actin 作为内参，用2-△△CT最小二乘法进行计算。每个样本重复3 个复孔，每次实验均重复3 次以上，以保证结果的稳定性。

1.3 统计学处理 采用Graphpad7.0 统计软件，计量资料以表示，组间比较采用配对t检验。P＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 RNA-seq 聚类分析结果见插页图1。

由插页图1 可见，不同处理组能够完整分开，两者对应的转录本表达差异较大，其中，红色代表差异转录本在分组样本中表达值高，绿色代表差异转录本在分组样本中表达值低。通过对两个处理组进行比较，得到2 256 个差异表达基因，其中上调表达基因845 个，下调表达基因1 411 个。

2.2 差异基因显著富集的GO 分析结果见图2。

根据2.1 分析结果中下调表达的差异基因的显著性水平构建分布图，可见在分子功能、生物学过程和细胞成分3 个类别基因中，显著下调的功能基因主要富集于：细胞转运和离子通道相关蛋白（离子转运体、钙离子、氯离子、金属离子跨膜转运等）、转录活性调节以及表观遗传修饰（组蛋白H3-K4 三甲基化修饰、表观遗传的负调控）等。

2.3 差异表达基因的通路显著性富集分析结果见插页图3。

由插页图3 可见，通过KEGG 数据库分析，下调基因明显富集于炎症相关的信号通路：PI3K-Akt 信号通路、MAPK 信号通路、IL-17 信号通路、趋化因子信号通路、cAMP 信号通路、补体相关通路等，此外还有一些代谢相关信号通路（甘油磷脂代谢和胆碱代谢等）。说明PD 主要影响炎症信号通路表达。

2.4 定量PCR 验证结果见图4。

由图4 可见，通过对测序结果中差异表达的5个基因（CCL-11、IL-22、IL-17、MMP-9 和EGF）进行定量PCR 验证，证明这5 个基因的表达趋势与测序结果一致，PD 处理后能显著抑制CCL-11、IL-22、IL-17、MMP-9 和EGF 基因的表达，且差异均有统计学意义（均P＜0.05），其中MMP-9 基因在PD 处理后差异显著（P＜0.01）。

3 讨论

革兰阴性菌感染过程中，机体会产生一系列免疫应答反应以清除病原，而免疫应答失控会导致疾病的发生，甚至脓毒症或脓毒症休克这类危及生命的重症[8-9]。LPS 感染引发的炎症反应甚至脓毒症及脓毒症休克过程中，心脏组织的受损不可避免，而内皮细胞在其中扮演着重要角色[10]。很多研究揭示了LPS 感染与心肌损伤的关系：LPS 感染首先被免疫细胞识别并引发炎症反应，导致内皮细胞骨架重构、VE-钙黏附素的变化引起CMECs 间黏附连接结构解体，结构改变，血管通透性增加，大量液体渗入心脏组织间隙，加重组织浮肿与细胞缺氧；炎性细胞大量吸附与浸润心肌，造成心肌细胞损伤[11-12]。本研究探讨了中药单体——PD 对LPS 引发的CMECs 细胞基因表达变化的影响，旨在探讨PD 对LPS 引起的CMECs 基因表达变化的影响及分子机制。

图2 差异基因显著富集的GO 分析结果（纵坐标为差异基因的功能名称，横坐标为P 值的负对数（-LgP），其值越大表明P 值越小，亦即该差异基因功能显著性水平越高）

图4 荧光定量PCR 验证相关基因的表达差异（与LPS 组比较，*P＜0.05，**P＜0.01）

人参是一种传统的中药材，对其有效成分人参皂苷（Rb1、Rb2、Rb3、Rc、Rd、Rh2 及Rg3 等）的药理作用已经有了广泛的研究，它们被证明在心血管疾病方面发挥一定的保护作用，能够拮抗钙离子通道在心肌缺血和再灌注中发挥保护作用；并能调整心肌细胞的能量代谢、抵抗心肌炎症等。Rb1 能够改善炎症诱导的动脉粥样硬化[13]，抑制肿瘤坏死因子α（tumour necrosis factor-α，TNF-α）、IL-6 等炎症因子的表达；此外，在心肌缺血再灌注损伤中，Rb1、Rb3 和Rd 均能够减少心脏的梗死面积，降低血清中的肌酸激酶（creatine kinase，CK）、乳酸脱氢酶（lactic dehydrogenase，LDH）和心肌肌钙蛋白Ⅰ（troponinI，cTnI）的水平，从而提高缺血再灌注后的心肌功能[14-16]。PD 分子量极小，更利于机体吸收发挥药理活性。但是其在LPS 引起的CMECs 损伤中是否发挥一定作用及其相关分子机制研究还较少。我们的研究通过RNA-seq 高通量测序技术在CMECs 中系统检测了PD 对LPS 引起的基因表达改变的影响，根据RNA-seq 结果可以发现，PD 处理能够显著降低LPS 感染引起的部分基因表达改变，包括一些转录因子活性基因、离子通道相关基因、表观遗传调节基因等，其中表达显著降低的基因主要集中在免疫相关信号通路（IL-17、PI3K-Akt、MAPK 信号通路等）、表观遗传通路以及CMECs 细胞代谢相关通路（胆碱、甘油磷脂代谢等），说明PD 可以抑制炎症反应，可能对LPS 引起的CMECs 炎症反应发挥抑制效应。此外，PD 能够显著改变表观遗传相关基因的表达，如组蛋白H3-K4 三甲基化修饰酶等，我们推测它可能通过影响表观遗传酶，调控转录活性影响炎症等相关基因的表达。

本研究结果对于揭示PD 的作用机制和作用靶点，以及对心血管内皮细胞基因表达的影响提供了系统性的实验基础，可能为临床上革兰阴性菌感染的治疗提供一定的理论依据。