正交试验优化葡萄籽总黄酮提取工艺

田 欢，张雨鑫，成超超，胡选生

(商洛学院 生物医药与食品工程学院，陕西 商洛 726000)

葡萄籽富含丰富的氨基酸、维生素和矿物质，具有较高的营养和药用价值[1-4]。黄酮是一类大量存在于植物中的天然有机化合物，具有调节内分泌、清除人体中超氧离子自由基、延缓衰老、增强机体免疫力、抗心脑血管疾病、抗炎镇痛、抑菌抗病毒等多种生理活性[5-6]，本研究以葡萄籽为原料，利用正交试验探究乙醇溶剂浸提法提取葡萄籽总黄酮的最佳工艺条件，为葡萄籽的开发利用提供参考。

1 材料与方法

1.1 试验材料

葡萄籽：回收于商洛学院生物医药与食品工程学院教学及新品酒研发过程中产生的葡萄籽；芦丁标准品购于西安晶博生物科技有限公司; 无水乙醇、石油醚、亚硝酸钠、硝酸铝、盐酸、氢氧化钠等其他试剂均为分析纯。

1.2 主要试验仪器

BJ-300多功能粉碎机(浙江德清拜杰电器有限公司)；LGJ-10D型冷冻干燥机(北京四环科学仪器厂有限公司)；DHG-9123A型恒温鼓风干燥箱(上海齐欣科学仪器有限公司)； RE-52AA旋转蒸发器(上海亚荣生化仪器厂)；HHS型电热恒温水浴锅(上海博迅实业有限公司)；UV-1100型紫外可见分光光度计(上海美析仪器有限公司)。

1.3 方法

1.3.1 芦丁标准曲线的绘制

分别移取0.00、0.25、0.50、0.75、1.00、1.25 mL芦丁标准液并将其置于25 mL容量瓶中，先加0.3 mL 5%的NaNO2溶液摇匀静置6 min，再加入0.3 mL 10%的Al(NO3)3溶液摇匀静置15 min，加4 mL 1 mol/L的NaOH溶液，最后用80%乙醇定容至标线，(得浓度为0.01～0.05 mg/mL芦丁溶液)，用可见分光光度计(λ=510 nm)测定吸光度值，以吸光值为纵坐标，芦丁标准液浓度为横坐标，绘制芦丁标准曲线[7]。

1.3.2 毛酸浆总黄酮提取率的测定

根据芦丁标准曲线计算样品中总黄酮的质量浓度，通过下式计算提取率。

(1)

式中：C-葡萄籽总黄酮的质量浓度，mg/mL；N-稀释倍数；V-样品液体积，mL；M-样品质量，g。

1.3.3 提取毛酸浆总黄酮单因素实验

以葡萄籽总黄酮的提取率为指标，液料比、乙醇浓度、提取时间、提取温度为考察因素，选择料液比 (1∶5、1∶10、1∶15、1∶20、1∶25、1∶30) 、乙醇浓度(30%、40%、50%、60%、70%、80%)、提取时间(1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、3.5 h)、提取温度(50、60、70、80、90、100℃)进行单因素试验。

2 结果与分析

2.1 芦丁标准曲线

以芦丁浓度(mg/mL)为x轴、吸光度(A)为y轴作标准曲线(图1)。

图1 芦丁标准曲线

由图1可知线性回归方程为：Y=20.04X+0.012，R2=0.9989。

2.2 单因素实验

2.2.1 料液比对葡萄籽总黄酮提取率的影响

料液比对葡萄籽总黄酮提取率的影响见图2。

图2 料液比对葡萄籽总黄酮提取率的影响

结果表明：葡萄籽中总黄酮的提取率先增大后减小，当料液比达到1∶10时，提取率最大，当料液比大于1∶10，提取率开始下降。在物料一定的情况下，料液比过低，总黄酮不易扩散至提取溶剂中。而过高的料液比则由于在反应已充分的情况下，没有起到提高提取率的作用，而且还会增加溶剂成本，不利于后续操作。

2.2.2 乙醇浓度对葡萄籽总黄酮提取率的影响

图3 乙醇浓度对葡萄籽总黄酮提取率的影响

乙醇浓度对葡萄籽总黄酮提取率的影响见图3。结果表明，总黄酮提取率随着乙醇浓度的升高而增大，当乙醇浓度为60%时，提取率最大，继续增加乙醇浓度，葡萄籽中总黄酮含量降低，根据相似相溶原理，极性相似可达到最大溶出度，当乙醇浓度达到60%时，溶剂与溶质极性较为相似，可达到最佳提取状态。并且在一定范围内，乙醇浓度超过一定值时，会使色素等杂质溶出量增加，不利于黄酮的提取。

2.2.3 提取时间对葡萄籽总黄酮提取率的影响

图4 提取时间对葡萄籽总黄酮提取率的影响

提取时间对葡萄籽总黄酮提取率的影响见图4。当提取时间低于2.5 h时，由于在一定时间内，反应时间的增加有利于黄酮类物质与有机溶剂反应，提取率增加；当提取时间高于2.5 h时，由于提取超过一定时间，其他化合物质的溶出会影响黄酮类物质的提取率，同时黄酮类物质因暴露时间过长而与空气发生氧化，大大降低提取效果，提取率下降。

2.2.4 提取温度对葡萄籽总黄酮提取率的影响

提取温度对葡萄籽总黄酮提取率的影响见图5。

图5 提取温度对葡萄籽总黄酮提取率的影响

随着提取温度的升高，在80℃处提取率最大，之后提取率下降，原因可能为加热温度过高导致原料内部的分子结构受到损害，影响提取效果。

2.3 葡萄籽总黄酮提取正交试验

2.3.1 正交试验因素水平设计

由单因素实验结果可知：料液比为1∶5～1∶15，乙醇浓度为50%～70%，提取时间为2～3 h，提取温度为70～90℃时，总黄酮的提取率达到最大值。综上分析，确定正交试验中的实验因素及水平，具体见表1。

表1 提取工艺正交试验因素水平设计

2.3.2 正交试验结果及分析

表2 正交试验结果表

由表2可知，葡萄籽总黄酮提取率的影响因子由大到小依次为：料液比>提取温度>提取时间>乙醇浓度。根据极差分析，较优水平为：A2B2C2D2, 即料液比1∶10、乙醇浓度60%、提取时间2.5 h、提取温度80℃。

由于本实验极差分析的较优水平A2B2C2D2与九组正交中较优组合A2B3C1D2不一致。在此条件下，平行实验3次，进行验证试验，结果见表3。

表3 正交结果验证试验

由表3可知，在A2B2C2D2条件下总黄酮提取率高于A2B3C1D2。因此得到最佳工艺参数为A2B2C2D2，即料液比1∶10、乙醇浓度60%、提取时间2.5 h、提取温度80℃。

3 结论

通过对葡萄籽总黄酮提取工艺条件的研究，在料液比为1∶10、乙醇浓度为60%、提取时间为2.5 h、提取温度为80℃时，葡萄籽总黄酮提取率最大，最大提取率为1.1321%。