响应面法优化五指毛桃多糖的提取工艺

唐 森，黄 霞，覃逸明，吴国勇，张 鹏*

(1.广西科技师范学院 食品与生化工程学院，广西 来宾 546119； 2.广西科技师范学院 特色瑶药资源研究与开发重点实验室，广西 来宾 546119； 3.广西科技师范学院 科研管理处，广西 来宾 546119)

五指毛桃，来自桑科榕属植物的干燥根，粗叶榕的叶形如五根手指，其果实则状如毛桃，因此被称为五指毛桃，又因其根部有椰奶的清香，又被称为五指牛奶、牛奶木、土黄芪等等，是一种药食同源的药用植物。是岭南地区习用中草药[1]。中医认为，五指毛桃性平、味甘、辛，对脾虚浮肿、肺痨咳嗽、食少无力、风湿痹痛、盗汗、产后无乳等症有很好的疗效，应用历史悠久，在广东、广西、香港等地民间常用其作为煲汤的食材，其保健作用广为认可[2]。研究表明，五指毛桃还具有止咳、平喘、祛痰、益气健脾、改善消化、保肝、抑菌、抗炎镇痛、补血、抗突变等生物活性[3-4]。多糖是一种天然高分子化合物，具有广泛的生物活性，在华夏很多中药材都以多糖作为主要成分之一，近年来引起各界的关注。

目前常用的植物多糖提取方法有溶剂提取法、超声波辅助溶剂提取法、微波辅助溶剂提取法、超声-微波协同提取法、酶解法、超临界流体萃取法等[5-6]。水热提取法是目前最常用的植物多糖提取方法，它具有操作简单、设备要求低、提取产物绿色无污染等优点。响应面试验设计通过相关实验采集数据，采取多元二次回归方程进行拟合自变量和响应值之间的函数关系，建立相应的数学模型，对二次多项式回归方程的计算分析来寻求最优工艺参数，是解决多变量问题的一种统计方法，其预测结果可信度高，能够快速确定多因素系统的最佳实验条件[7]。本试验以五指毛桃作为原料，蒸馏水作为提取剂，采用水浴提取法对五指毛桃水溶性多糖进行提取，并在单因素试验结果的基础上进行响应面法优化，确定水浴提取法提取五指毛桃水溶性多糖的最佳提取工艺。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

五指毛桃购于亳州市众益堂中药材销售有限公司，经广西科技师范学院特色瑶药资源研究与开发重点实验室张鹏博士鉴定为五指毛桃，试验所用葡萄糖、浓硫酸、苯酚、乙醇、正丁醇、三氯甲烷均为国产分析纯试剂。

1.2 仪器与设备

循环水多用真空泵(SHZ-D(III)型 巩义市科瑞仪器有限责任公司)；恒温水浴锅(HH-S4型 金坛市医疗仪器厂)； 数控超声波清洗器(KQ-300DB型 昆山市超声仪器有限公司)； 紫外/可见分光光度计(UV-9600型 北京北分瑞利分析仪器(集团)公司)；台式高速冷冻离心机(H3-20KR型 湖南可成仪器设备有限公司)；电子分析天平(FA-2004B 型 上海越平科学仪器有限公司)； 玻璃仪器气流烘干器(C-20型 上海贝仑仪器设备有限公司)； 中草药粉碎机(FW-135型 天津市泰斯特仪器有限公司)。

1.3 方法

1.3.1 五指毛桃多糖的提取

将块状的五指毛桃用高速万能粉碎机粉碎，80目过筛后在干燥箱内烘干至恒重，备用。精确称取预处理后五指毛桃固体粉末2.00 g于锥形瓶中，按照试验所需的液料比、提取时间、提取温度进行提取试验，所得提取提取液经真空抽滤、稀释、离心，所得溶液即为五指毛桃粗多糖溶液。

1.3.2 葡萄糖标准曲线的绘制[8]

采用苯酚-硫酸法显色，用紫外分光光度计测定吸光度，回归方程为：A = 0.0832C-0.1704，R2= 0.9994，线性范围为3.75～11.25 μg·mL-1。

1.3.3 五指毛桃多糖提取率的测定[9]

吸取2 mL五指毛桃粗多糖提取液于容量瓶中，加入适量蒸馏水进行稀释，精密吸取2 mL五指毛桃粗多糖稀释液于具塞试管中，加入Savage试剂(三氯甲烷∶正丁醇=4∶1)，混匀，2000 r·min-1离心20 min，将上清液转至刻度试管中，得到供试品溶液。按照葡萄糖标准曲线方法测定吸光度，由回归方程计算五指毛桃粗多糖溶液中多糖的浓度，按下式计算五指毛桃粗多糖溶液中多糖的含量：

式中：C为粗提物样液葡萄糖质量浓度(μg·mL-1)，D为稀释倍数，m为样品质量(μg)。V为最初样品定容体积，mL。

1.4 单因素试验设计

探究提取时间、提取温度、液料比对五指毛桃中水溶性多糖提取率的影响。固定液料比60∶1 mL/g，提取温度80℃，设定提取时间30、60、90、120、150 min；固定液料比60∶1 mL/g，提取时间60 min，设定提取温度50、60、70、80、90℃；固定提取温度80℃，提取时间60 min，设定液料比40∶1、50∶1、60∶1、70∶1、80∶1、100∶1 mL/g。

1.5 响应面试验设计

在最佳单因素试验结果的基础上，选择主要的3个因素：提取时间(A)、提取温度(B)、液料比(C)为自变量，以水溶性多糖提取率为主要目标，利用Design-Expert 8.0.6的中心组合实验设计原理进行3因素3水平的实验设计，并确定水浴提取方法的最佳工艺条件，如表1所示为响应面设计测试因子的水平和编码表。

表1 响应面因素与水平

1.6 验证工艺

选取响应面试验得出的最优提取工艺，平行3组，计算多糖提取率，以确定五指毛桃多糖的最优提取工艺。

2 结果与分析

2.1 提取时间单因素试验结果

固定液料比60 mL/g，提取温度80℃，考察提取时间为30，60，90，120 min时的多糖提取率。如图1所示，提取时间60 min时，多糖提取率达到最大值，1.12%。当时间继续延长时，多糖提取率呈下降趋势。因此最佳提取时间为60 min。

图1 提取时间对多糖提取率影响

2.2 提取温度单因素试验结果

固定料液比60 mL/g，提取时间60 min，考察提取温度为50，60，70，80，90℃时的多糖提取率。如图2所示，提取温度80℃时，多糖提取率达到最大值，1.35%。温度升高说明分子之间的运动更剧烈，反应的效率更快，在较高的温度里，多糖的溶解度也会增大，当继续提高温度时，多糖提取率就会呈现下降趋势，说明温度过高，导致提取率下降，所以选取80℃为最佳提取温度。

图2 提取温度对多糖提取率影响

2.3 液料比单因素试验结果

固定提取温度80℃，提取时间60 min，考察液料比为40∶1，50∶1，60∶1，80∶1和100∶1 mL/g时的多糖提取率。如图3所示，液料比60∶1 mL/g时多糖提取率达到最大值1.18%。当水量继续增加时多糖提取率反而呈下落的趋势，可能是由于溶剂量太大，影响了对五指毛桃多糖的溶出度，从而影响了多糖的提取率。因此提取最佳液料比为60∶1 mL/g。

图3 液料比对多糖提取率影响

2.4 响应面试验

2.4.1 响应面试验设计

根据响应面法设计三因素试验考察，本次实验共有分为两种类型的17个试验点，第一类为析因点，是自变量取值在A、B、C所构成的三维顶点，析因点共有12个。第二类为位于区域中心的各自变量均为零水平的重复试验点，用来检验回归方程与中心试验点的拟合情况，同时可以提供剩余自由度，以提高试验的精度，本次试验设计的零点实验重复5次。对计算出的试验条件按步骤 1.3 进行多糖提取试验，求得相应条件下的多糖提取率，以 Design expert 8.0.6.1 版软件对所得试验结果进行分析，所得结果见表2。

表2 响应面试验条件及结果

在试验结果的基础上以 A(提取时间)、B(提取温度)、C(液料比)为自变量，Y(提取率)为响应值，求得多糖提取率对三因子的拟合回归方程为Y=1.29+0.075A+0.00375B-0.041C+0.063AB+0.013AC-0.010BC-0.066A2-0.19B2-0.12C2。

表3 响应面分析结果

注：*p<0.05 表示差异显著，**p<0.01 表示差异极显著。

模型的方差分析由软件Design-Expert 8.0.6完成，结果如表3所示，分析表格中的数据，通过P值来判断[17]，发现拟合出的方程中各个因子对响应值的影响是显著性的。由表3能够得出，回归模型极显著(P<0.0001)，失拟项不显著(P=0.242>0.05)，R2=0.9948，结果表明，此模型具有良好的拟合程度，每一个单因素变量与响应值之间都存在着显著的线性关系，可以用来预测和分析出响应面值，分析多糖的提取率。回归方程的各项方差分析表明，A、AB对五指毛桃水溶性多糖有极显著的影响(P<0.01)，二次项A2、B2、C2对提取率的影响极显著(P<0.01),说明五指毛桃多糖与各个因子之间不仅仅是简单的线性关系。因子C的作用显著(P<0.05)，因子B、AC、BC对五指毛桃水溶性多糖提取率无显著影响(P>0.05)。

2.4.2 等高线图及响应面图分析

由图 4相关因素的3D响应面图及等高线图结合可看出，随着提取时间的延长，五指毛桃多糖提取率逐渐增大，当温度低于80℃时，多糖提取率随着温度的升高而增大，这是因为温度升高，分子运动速度加快，渗透、溶解、扩散速度加快，溶液对多糖的溶解度增大。然而当温度温度高于80℃后，由于高温使热稳定性差的多糖结构发生降解从而造成多糖提取率降低。以上这三个因素对多糖的提取率都有一定的影响，其中影响最为显著的是提取的时间，其次到液料比，受影响最小的是提取的温度，在等高线图中，提取温度跟提取时间椭圆形状最为明显，这就说明提取温度跟提取时间之间的相互作用对多糖提取率的影响较大，提取时间跟提取液料比之间的相互作用次之，而提取温度跟时间之间的交互作用几乎为圆形，说明这两个因素之间的相互作用对多糖的提取率影响不大。

图4 液料比、提取时间、提取温度对五指毛桃多糖提取率影响的响应面与等高线

Fig.4 Response surface and contour line of the effect of liquid-material ratio,extraction time and extraction temperature on the extraction rate of polysaccharide from five-fingered mulberry peach

2.4.3 响应面模型验证

根据软件Design-Expert 8.0.6预测的五指毛桃多糖提取最佳工艺为：提取时间83.14 min，提取温度82.03℃，液料比54.16∶1 mL/g。在该条件下五指毛桃多糖提取率的理论值可达1.31244 %。考虑到试验的实际操作性，将提取条件修正为时间83 min，温度82℃，液料比54∶1 mL/g。试验重复 3 次，所得五指毛桃多糖实际提取率为1.312%±0.005%，该结果与理论值较为吻合。

3 结论

本试验在单因素试验的基础上，采用响应面试验设计优化五指毛桃水溶性多糖的提取工艺。试验结果表明，建立的二元多项式回归方程的拟合度较好，由其预测并根据实际情况修正得到五指毛桃水溶性多糖最佳的提取工艺条件为：提取时间83 min，提取温度82℃，液料比54∶1 mL/g。在此条件五指毛桃水溶性多糖的提取率为1.312%±0.005%。由此可见，采用水浴

提取法提取，结合响应面试验优化参数，是水溶性多糖提取的一种可靠有效的方法。可见，运用响应面法优化五指毛桃多糖提取工艺参数切实可靠，为后续进一步研究提供相应基础数据，以期开发为药物或保健食品。