针对不同浓度范围的接触性DNA比较几种常见纯化方法

吴 婷，朱洪建 ，陈瑶清，文佳乐，吴乔丹

(1.湖南警察学院，湖南 长沙 410138；2.岳麓公安分局刑事科学技术室，湖南 长沙 410006)

接触性DNA(Touch DNA)是指通过皮肤接触而遗留在客体表面的DNA，主要来源于人体脱落细胞[1]。当前公安实战中，现勘人员提取到的接触类检材越来越多，而接触类检材样本中DNA含量很少，且存在大量PCR抑制剂，使得这类检材检出成功率很低。通过前期的实验研究，我们建立了应用免疫胶体金技术提取接触性DNA的孵育条件[2]，为本研究奠定了实验基础。本研究对目前国内实验室常用的接触性DNA提取纯化方法进行初步的比较,旨在探索针对不同浓度范围的接触性DNA能有效提高检测成功率与准确性的纯化方法。

1 材料与方法

1.1 实验试剂及来源

10 ng/μLDNA标准品：本实验室。抗-DNA多克隆抗体免疫胶体金冻干粉剂：北京博奥森生物技术有限公司。灭菌纯水：屈臣氏。5% Chelex-100溶液：本实验室。EZ1 DNA Tissue试剂盒：QIAGEN公司。10 ng/μL蛋白酶K溶液:本实验室。TES缓冲液：本实验室。PCR反应试剂：PowerPlex21试剂盒，Promega公司。

电泳试剂：Hi-DiTM 甲酰胺(AB公司)；PPlex21 Allelic Ladder(Promega公司);CC5 ILS500(Promega公司)。

1.2 主要仪器

恒温混匀仪Thermomixer comfort：德国Eppendorf。5424小型台式离心机：德国Eppendorf公司。多用途高速台式离心机: 美国Thermo公司。微量振荡器：广州IKA公司。 微量移液器：Gilson。BioRobot EZ1提取工作站：德国QIAGEN公司。PCR9700扩增仪：美国ABI公司。3130xl Genetic Analyzer：美国ABI公司。Microcon 100超滤管:美国Millipore公司。

1.3 针对不同浓度范围的接触性DNA比较几种常见纯化方法

(1) 抗-DNA多克隆抗体免疫胶体金溶液的配置：取免疫胶体金冻干粉剂，加灭菌纯水溶解，配置成浓度为0.4 mg/mL的免疫胶体金溶液备用。

(2)模拟接触性DNA溶液的制备：取DNA标准品2800M(10 ng/μL)加入相应比例的灭菌纯水分别制成终浓度为0.05 ng/μL的DNA溶液备用。

(3)分组：在建立了免疫胶体金技术针对接触性DNA的孵育条件后，为了进一步研究免疫胶体金技术针对接触性DNA的提取纯化能力，设计了这部分实验。为了模拟接触性DNA的特点，将浓度为0.05 ng/μLDNA标准品2800M按样本中DNA含量分为A-G 7组,并进行10组平行试验，即A组0.025 ng、B组0.05 ng、C组0.1 ng、D组0.2 ng、E组0.5 ng、F组1ng和G组5 ng，分别配制成实验用液各200 μL，即：

A组(0.025 ng):取浓度0.05 ng/μL DNA溶液0.5 μL，终浓度为0.000125 ng/μL；

B组(0.05 ng):取浓度0.05 ng/μL DNA溶液1 μL，终浓度为0.00025 ng/μL；

C组(0.1 ng):取浓度0.05 ng/μL DNA溶液2 μL，终浓度为0.0005 ng/μL；

D组(0.2 ng):取浓度0.05 ng/μL DNA溶液4 μL，终浓度为0.001 ng/μL；

E组(0.5ng):取浓度0.05 ng/μL DNA溶液10 μL，终浓度为0.0025 ng/μL；

F组(1 ng):取浓度0.05 ng/μL DNA溶液20 μL，终浓度为0.005 ng/μL；

G组(5 ng):取浓度0.05 ng/μL DNA溶液100 μL，终浓度为0.025 ng/μL。

(4)抗DNA多克隆抗体免疫胶体金法：采用200 μL体系，往样本组中加入纯水补足体系，然后分别加入5 μL免疫胶体金，室温下振荡孵育15 min，13000 r/min离心10 min，吸弃上清，留沉淀，取2.5 μL沉淀，直接用于PCR反应。剩余沉淀存放于4℃冰箱。

(5) EZI法：采用200 μL体系，往样本中加入G2缓冲液、10 μL PK补足体系，震荡混匀，置于恒温混匀仪中56℃下1 h；后取出于100℃加热8 min；13000 r/min离心3 min，转移上清液于另一0.5 mL离心管中，弃沉淀；使用EZ1 DNA Investigator Kits进行样品处理，使用BioRobot EZ1 工作站进行DNA提取和纯化，洗脱液选项：水溶液、50 μL。提取液待扩增。

(6)Mirocon 100超滤法：采用200 μL体系，往样本中分别加入纯水补足体系并混匀；将Microcon 100超滤管分别套在产品随带的1.5离心管中，将上述样本分别加入到4个超滤管内；室温25℃ 500 g离心12 min；去掉1.5 mL离心管，将超滤管反转套在另一干净的1.5 mL离心管中；室温25℃ 1000 g离心3 min，膜上的DNA回收到离心管中待扩增。

(7)Chelex-100法：采用200 μL体系，往样本中分别加入 5% Chelex-100溶液、6 μL PK补足体系；置于恒温混匀仪中56℃下1 h；后取出于100℃加热8 min；13000 r/min离心3 min，转移上清液于另一0.5 mL离心管中待扩增，弃沉淀。

(8)PCR扩增：使用GeneAmp PCR System 9700型扩增仪(AB公司)和PowerPlex21试剂盒(Promega公司)。PCR反应液(4×模板)；引物混合物(2×Primer，2×Mix)；去离子水(2×water)。进行30次循环。扩增程序为：96℃，1 min，循环0次；94℃，10s，59℃，1 min，72℃，30 s，30次循环；60℃，10 min，4℃，forever。其余操作过程按照试剂和仪器说明书进行。

(9) 扩增产物检验：取PCR扩增产物2 μL加入8 μL甲酰胺和2 μL ILS500(Promega公司)经热变性后，使用3130XL Genetic Analyzer(ABI公司)进行毛细管电泳，用Genemapper软件进行分析，得出等位基因分型。

2 实验结果分析

通过对实验后得到DNA图谱的观察比较，结果如表1。

表1 针对 A-G组四种纯化方法DNA检测结果的比较

实验结果表明：(1)针对F-G范围内四种纯化方法DNA 检测结果，免疫胶体金法、Mirocon100法效果相当，EZI法次之，但均优于Chelex-100；针对A-E范围内四种纯化方法DNA 检测结果，免疫胶体金法>Mirocon100法> EZI >Chelex-100；针对B-E范围内，除免疫胶体金法外，EZI法、Mirocon100法、Chelex-100法均不理想；针对A-B范围内,不含B，四种纯化方法均不理想；

(2)免疫胶体金技术针对不同浓度范围的接触性DNA的提取纯化效果明显优于EZI法、Mirocon100法、Chelex-100法。因此，在F-G范围内的接触性DNA选用免疫胶体金法/Mirocon100法,或Chelex-100/EZI+免疫胶体金法；在A-E范围内可选用免疫胶体金与其他方法联合。

3 结论与不足

3.1 结论

本研究应用免疫胶体金技术针对不同浓度范围的模拟接触性DNA的提取纯化效果明显优于EZI法、Mirocon100法、Chelex-100法。抗-DNA多克隆抗体标记胶体金制备成的免疫胶体金，用于模拟接触性DNA的提取，整个实验操作简单，时间短，且实验始终在同一管内进行反应，减少了微量检材样本在多次转移过程中造成的损耗，节省人力成本的同时降低了实验耗材成本。

3.2 不足

关于针对提取纯纯化方法的比较。本研究只对目前国内公安法医DNA实验室常用的提取纯化方法进行了初步的比较，且样本容量设置仍然偏低，由于时间、经费以及实验条件等因素的限制，没能进行PCR实时定量来指导实验，没能采纳国际先进的实验方法加入比较，实验的模拟样本条件设置也过于单一，希望以后能进一步充实相关研究。