食甲基菌吡咯喹啉醌生物合成相关基因的筛选及表型鉴定

薄明井，寇航，陈静，张惟材，葛欣，熊向华

1.河北大学 生命科学学院，河北 保定 071000；2.军事医学研究院 生物工程研究所，北京 100071

吡咯喹啉醌（pyrroloquinoline quinone，PQQ）是甲基营养菌合成的一种醌类化合物，是NAD和FAD之外的第三类氧化还原酶辅酶[1]。PQQ具有重要的生理功能，如清除氧自由基、增强线粒体功能、调节免疫、促进认知、防治辐射损伤和肝损伤、促进创伤愈合等[2]。PQQ作为促进认知的功能食品成分在美国已上市多年[3]，显示其具有良好的药用保健价值和广阔的市场应用前景。

PQQ的化学合成工艺复杂、污染严重、成本高昂，生物合成是目前PQQ工业化制备的首选工艺。迄今发现只有某些革兰阴性菌能产生PQQ，如乙酸钙不动杆菌、肺炎克雷伯菌、扭脱甲基杆菌、氧化葡糖杆菌等[4]。本实验室前期通过山梨糖脱氢酶（sorbose dehydrogenase，SDH）活性电泳法从土壤中筛选得到一株PQQ产生菌MP688[5]，已完成全基因组测序和基因组规模代谢网络模建[6-7]。MP688经过多轮物理和化学诱变后得到高产菌株J1-1，摇瓶培养PQQ产量达到100 mg/L左右。继续通过传统物理化学诱变来提高PQQ产量已经很难，J1-1菌株的代谢工程改造是另一种有效手段。代谢工程理性改造建立在PQQ生物合成相关基因的完整注释之上，但目前已知的PQQ生物合成相关基因功能并不能组成完整的PQQ生物合成路线，依然存在未知的PQQ生物合成相关基因等待发现。为筛选到新的PQQ生物合成相关基因，本研究对J1-1菌株进行Tn5转座诱变，筛选得到1株PQQ生物合成水平显著下降的突变株，经插入位点鉴定确认了突变基因，同源重组敲除对应基因后进一步验证表型。

1 材料与方法

1.1 材料

食甲基菌J1-1、大肠杆菌DH5α λ-pir感受态细胞、质粒pCM66和pGX由本实验室保存；大肠杆菌DH5α感受态细胞、快速质粒小提试剂盒、细菌基因组DNA提取试剂盒、琼脂糖凝胶DNA回收纯化试剂盒购自北京天根生化科技有限公司；限制性内切酶购自Thermo公司；T4DNA连接酶、pEASY-Uni Seamless Cloning and Assembly Kit、DNA标准分子量购自北京全式金生物技术有限公司；RNA提取试剂盒Bacteria RNA Extraction Kit、逆转录 HiScriptⅢ1st Strand cDNA Synthesis Kit（+gDNA Wiper）试剂盒购自南京诺唯赞有限公司；PCR引物（表1）合成及测序由北京擎科科技股份有限公司完成；其他生化试剂（分析纯）购自国药集团。

表1 PCR引物序列

低产培养基（LM）：MgSO4·7H2O 0.2 g/L，KH2PO41.4 g/L，（NH4）2SO43.0 g/L，Na2HPO43.0 g/L，MnCl2·4H2O 5.0 mg/L，ZnSO4·7H2O 5.0 mg/L，CuSO4·5H2O 0.5 mg/L，柠檬酸铁 60.0 mg/L，甲醇10 mL/L，pH7.0，115℃灭菌30 min。

高产培养基（HM）：MgSO4·7H2O 0.2 g/L，KH2PO42.8 g/L，（NH4）2SO43.0 g/L，Na2HPO46.0 g/L，MnCl2·4H2O 5.0 mg/L，ZnSO4·7H2O 5.0 mg/L，CuSO4·5H2O 0.5 mg/L，柠檬酸铁60.0 mg/L，甲醇10 mL/L，pH7.0，115℃灭菌30 min。

1.2 分子生物学操作

PCR、酶切、连接、转化等常规分子生物学操作参照文献方法[8]。

1.3 Tn5突变体库构建

从 EN-Tn5＜R6Kγori/KAN-2＞TNP Transposome Kit中取 1 μL Transposome加入 100 μL 食甲基菌J1-1感受态细胞混匀，冰浴5 min后转移到预冷的电击杯中，2.5 kV电压电击后迅速加入1 mL LM培养基，30℃、200 r/min复苏培养2 h，涂布于LM平板（含卡那霉素50 μg/mL），倒置培养2～3 d。挑取单菌落于5 mL LM液体培养基（含卡那霉素50 μg/mL）中，30℃、200 r/min培养3 d，连续传3代后仍有卡那霉素抗性，说明转座序列可以稳定传代，以此方法建立突变体库。

1.4 PQQ合成突变株筛选及PQQ合成水平检测

PQQ是棕红色小分子化合物，在食甲基菌J1-1发酵过程中被逐渐分泌到胞外[9]，使发酵液呈红色，发酵液颜色深浅可直观反映PQQ合成水平高低。挑取1.3的单菌落于5 mL LM液体培养基（含卡那霉素50 μg/mL）中，以J1-1为对照，30℃、200 r/min振荡培养3 d，挑选与对照菌发酵液颜色差异较大的菌株，采用分光光度法[10]检测发酵液中PQQ合成水平。

1.5 质粒拯救法鉴定插入位点

按照质粒拯救法[11]进行。测序结果与J1-1基因组DNA序列进行比对，确定Tn5插入位点。

1.6 mpq-0708基因敲除

以J1-1基因组为模板，用引物0708-up-F/0708-up-R和0708-down-F/0708-down-R扩增上游及下游同源臂基因；以质粒pGX-Gm为模板，用引物0708-gen-F/0708-gen-R扩增庆大霉素（Gm）基因片段。扩增产物经琼脂糖凝胶电泳后切胶回收。将上、下游同源臂基因、Gm基因和经XhoⅠ、NotⅠ双酶切的载体pGX-Gm用pEASYUni Seamless Cloning and Assembly Kit重组转化，获得pGX-up-Gm-down重组质粒。

质粒构建成功后，以pGX-up-Gm-down质粒为模板，用引物0708-up-F/0708-down-R扩增片段up-Gm-down，纯化后电击转入J1-1感受态细胞，涂布LM平板（含Gm 50 μg/mL），30℃培养3 d，从平板上挑取单菌落，用引物0708-1700-F/0708-gen-R及0708-1700-R/0708-gen-F扩增2500 bp的up-gm及gm-down片段，用引物0708-gen-F/0708-gen-R扩增800 bp的Gm片段，验证是否敲除成功。

1.7 敲除菌株表型测定

挑取野生菌J1-1、敲除菌J1-1Δ0708单菌落于5 mL LM液体培养基中于30℃活化24 h，按1%的接种量分别接种至100 mL LM及HM液体培养基中，30℃同步培养，间隔12 h取样测定菌液D600nm值及PQQ相关指标，绘制生长曲线及PQQ生物合成曲线。

1.8 NADH/NAD+比率测定

采用CheKine NAD/NADH Assay Kit试剂盒测定野生菌J1-1和敲除菌J1-1Δ0708的NADH及NAD+含量，计算 NADH/NAD+比值。

1.9 转录组数据分析

试管活化野生菌J1-1后按1%接种量分别接种至100 mL LM及HM液体培养基中，30℃、200 r/min培养60 h后收集菌体，用试剂盒提取RNA并逆转录为cDNA，送擎科公司进行转录组测序，分析高产低产条件下相关基因的转录水平。

2 结果

2.1 Tn5转座突变体库构建、突变株筛选及表型鉴定

Tn5转座诱变构建的J1-1突变体库库容量为1.0×105，从中筛选到1株与野生菌J1-1发酵液颜色差异显著的突变株5-179，与野生菌J1-1发酵液呈红色相比，该突变株发酵液颜色接近白色（图1）。菌体量及PQQ合成水平定量检测结果表明，突变菌5-179的生长速度、PQQ生物合成速度、最终菌体量及PQQ产量都比野生菌J1-1低。到达平台期后突变菌5-179最终菌体量为野生菌J1-1的55.93%，最终PQQ产量仅为野生菌J1-1的23.76%（图2）。实验结果表明5-179突变菌的PQQ生物合成水平显著下降。

图1 野生型J1-1及突变株5-179发酵液

图2 突变株5-179在HM中的生长曲线（A）和PQQ合成水平曲线（B）

2.2 Tn5转座突变株插入位点鉴定

质粒拯救法扩增得到的片段测定序列经与J1-1基因组序列比对后，确定插入位点为染色体第705454位，位于mpq-0708基因内部（705337～705933）。如图 3，mpq-0708基因位于 NADH-醌氧化还原酶基因簇（nuoABCDEF）内，编码NADH-醌氧化还原酶（EC：1.6.5.3）C亚基。KEGG分析结果表明NADH-醌氧化还原酶的功能是将NADH转化为NAD+并产生能量。5-179突变株中nuoC基因为Tn5转座插入而失活，nuoC基因3′端其他基因转录也会受到影响，最终会导致NADH-醌氧化还原酶整体功能受损。

图3 5-179突变株Tn5插入位点

2.3 mpq-0708基因敲除

以敲除菌基因组为模板进行组合PCR鉴定，上游同源臂up-Gm基因、下游同源臂down-Gm基因和单独Gm基因3个组合分别扩增出2500、2500、800 bp的片段，而以野生菌J1-1基因组为模板时均为阴性，说明mpq-0708基因敲除成功。结果见图4。

图4 敲除菌J1-1Δmpq-0708的组合PCR鉴定

2.4 敲除菌表型测定

定量检测高产HM培养基中敲除菌J1-1Δmpq-0708和野生菌J1-1的菌体量及PQQ合成水平，结果表明敲除菌生长速度和最终菌体量均低于野生菌，PQQ生物合成速度及最终PQQ产量同样如此。敲除菌到达平台期时最终菌体量仅为野生菌的14.87%，最终PQQ产量仅为野生型J1-1的3.15%（图5A）。敲除菌与Tn5转座诱变突变菌表型变化方向一致，相对于野生菌均下降，敲除菌下降幅度相对更大一些。

低产LM培养基中敲除菌及野生菌检测结果表明，前期敲除菌生长速度稍快于野生菌，后期生长速度和菌体量与野生菌均无显著差异。敲除菌PQQ生物合成速度显著低于野生菌，最终PQQ产量仅为野生菌的52.80%（图5B），变化趋势与在HM培养基中相同。

同时测定了低产LM培养基中敲除菌及野生菌的NADH及NAD+含量，前48 h敲除菌NADH/NAD+比值低于野生菌（图5C），推测是因为敲除了mpq-0708基因，导致NADH醌氧化还原酶将NADH转化为NAD+的能力下降。NADH/NAD+比值反映细胞的能量状态，比值越高表明细胞代谢越旺盛，低产LM培养基中敲除菌及野生菌的NADH/NAD+比值均在第48 h达到最大值，与菌体比生长速度及PQQ比生产速率相符（图5B、C）。

2.5 转录组数据分析

转录组数据分析结果显示，与低产培养基相比，在高产培养基中，mpq-0708基因所在基因簇的6个基因的转录水平是上调的（图6A），PQQ生物合成相关基因mpq-1589（pqqE）、mpq-1590（pqqD）、mpq-1591（pqqC）、mpq-1592（pqqB）的转录水平也是上调的（图6B），mpq-0708基因簇与PQQ生物合成基因簇及PQQ产量变化方向一致，证明能量代谢与PQQ生物合成正相关（图5A），提示mpq-0708基因的转座诱变和敲除有可能通过下调细菌能量代谢水平从而降低PQQ产量。

图5 野生菌J1-1、敲除菌J1-1Δmpq-0708在HM培养基（A）、LM培养基（B）中的生长曲线及PQQ合成水平曲线，以及在LM中的NADH/NAD+比值测定（C）

图6 野生菌J1-1在低产LM及高产HM培养基中NADH-醌氧化还原酶基因簇表达水平（A）和PQQ生物合成相关基因表达水平（B）

3 讨论

Tn5转座子属于复合型转座子，可通过抗性筛选。因在宿主中单拷贝复制，所以相比于常规的转座技术，Tn5具有突变性状稳定、突变位点易定位等优势[12]；同时Tn5转座还有操作简单、转化效率高，能够快速获得大量稳定遗传的Tn5转座突变株等特点。本研究构建了库容量为1.0×105的Tn5突变体库，筛选到一株PQQ产量明显下降的突变株5-179，且其他文献报道也筛选出相应的PQQ产量下降的菌株[13]，这些结果表明利用Tn5转座诱变技术筛选食甲基菌J1-1中PQQ合成基因的方法是可行的。

NAD是氧化还原酶辅酶，其氧化型（NAD+）和还原型（NADH）的比值是细胞能量代谢水平的重要指标，NADH/NAD+比值降低表明细胞新陈代谢能力下降，菌体生长进入衰退[14-15]。经鉴定发现本研究筛选到的突变株5-179其插入位点位于NADH-醌氧化还原酶亚基C（nuoC）编码区内。nuoC是NADH醌氧化还原酶周质空间的一部分，其部分氨基酸残基（Glu138、Glu140和Asp143）对NADH酶的组装及活性是必需的[16]。Tn5插入该基因簇内部，干扰了细胞能量代谢进而影响菌体生长和PQQ合成。同源重组敲除相应基因后表型与Tn5转座诱变表型一致。

此外，PQQ自身也是除NAD和FAD之外的第三类氧化还原酶辅酶，PQQ和NAD均与细胞能量相关，本研究结果提示PQQ合成水平和NADH/NAD+比值相互关联，具体机制有待进一步探讨。